布魯菌病是由布魯菌感染引起的人畜共患細(xì)菌性傳染病,感染后主要引起動(dòng)物流產(chǎn)和人的波狀熱。布魯菌感染宿主細(xì)胞后能通過多種方式逃逸宿主的免疫反應(yīng),從而在宿主細(xì)胞內(nèi)建立長(zhǎng)期持續(xù)性的感染。闡明布魯菌逃逸宿主免疫的機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步防控布魯菌病具有重要意義。本研究通過對(duì)布魯菌感染的巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,構(gòu)建了布魯菌感染巨噬細(xì)胞后相關(guān)免疫分子動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,進(jìn)一步用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,鑒定到多個(gè)免疫關(guān)鍵分子,選取其中3個(gè)重要分子進(jìn)行研究,從不同宿主分子的角度闡述布魯菌逃逸免疫的新機(jī)制。布魯菌感染巨噬細(xì)胞后期能下調(diào)表達(dá)TXNIP基因,進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)布魯菌感染能夠下調(diào)表達(dá)TXNIP蛋白,其下調(diào)表達(dá)依賴于活菌以及布魯菌的IV型分泌系統(tǒng),在細(xì)胞內(nèi)則通過一氧化氮（NO）來調(diào)控TXNIP的表達(dá),而抑制NO的表達(dá)后能明顯恢復(fù)TXNIP的表達(dá)。NO的產(chǎn)生也依賴于布魯菌的IV型分泌系統(tǒng)。說明布魯菌通過IV型分泌系統(tǒng)影響NO的產(chǎn)生進(jìn)而調(diào)控TXNIP的表達(dá)。敲除TXNIP基因后布魯菌的胞內(nèi)存活顯著提高,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),布魯菌通過減少活性氧和NO的產(chǎn)生來減弱巨噬細(xì)胞的殺傷作用,以利于其胞內(nèi)存活。布魯菌感染骨髓來源... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 布魯菌病原學(xué)與致病機(jī)制
        1.1.1 布魯菌的病原學(xué)
        1.1.2 布魯菌致病機(jī)制
    1.2 布魯菌的免疫
        1.2.1 布魯菌感染引起的固有免疫
        1.2.2 布魯菌感染引起的適應(yīng)性免疫
    1.3 布魯菌逃逸宿主的免疫
        1.3.1 布魯菌干擾固有免疫信號(hào)通路
        1.3.2 布魯菌調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫
        1.3.3 布魯菌調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡
        1.3.4 布魯菌通過其他方式逃逸宿主免疫
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 布魯菌感染巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及免疫關(guān)鍵分子鑒定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 菌株,細(xì)胞系
        2.1.2 相關(guān)試劑
        2.1.3 相關(guān)溶液及試劑配制
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.1.5 布魯菌感染條件的確立及轉(zhuǎn)錄組樣本的準(zhǔn)備
        2.1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析
        2.1.7 熒光定量PCR篩選布魯菌逃逸免疫相關(guān)分子
        2.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 布魯菌感染條件的確定
        2.2.2 轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析結(jié)果
        2.2.3 篩選布魯菌逃逸免疫的關(guān)鍵分子
    2.3 討論
第三章 布魯菌通過下調(diào)TXNIP蛋白來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌株,質(zhì)粒和細(xì)胞系
        3.1.2 抗體與相關(guān)試劑
        3.1.3 相關(guān)溶液及試劑配制
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)布魯菌感染后巨噬細(xì)胞后TXNIP的表達(dá)變化
        3.1.6 通過Crispr敲除TXNIP基因的細(xì)胞系
        3.1.7 免疫熒光和菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)布魯菌胞內(nèi)存活
        3.1.8 熒光定量PCR檢測(cè)布魯菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 細(xì)胞后相關(guān)因子變化
        3.1.9 蛋白免疫印跡檢測(cè)布魯菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)
        3.1.10 流式檢測(cè)布魯菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 細(xì)胞后活性氧產(chǎn)生
        3.1.11 Griess法檢測(cè)布魯菌感染TXNIP~(+/-)RAW264.7 細(xì)胞后一氧化氮產(chǎn)生
        3.1.12 通過菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)原代細(xì)胞中TXNIP對(duì)布魯菌胞內(nèi)存活的影響
        3.1.13 通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)小鼠體內(nèi)TXNIP表達(dá)變化
        3.1.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 布魯菌感染巨噬細(xì)胞后減弱TXNIP的表達(dá),其下調(diào)表達(dá)依賴于活菌及Ⅳ分泌系統(tǒng)
        3.2.2 缺失TXNIP后對(duì)布魯菌的胞內(nèi)存活的影響
        3.2.3 缺失TXNIP對(duì)布魯菌感染后相關(guān)蛋白表達(dá)和細(xì)胞因子的影響
        3.2.4 布魯菌通過減少巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
        3.2.5 布魯菌通過減少巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
        3.2.6 TXNIP的下調(diào)表達(dá)不依賴于IRE1-miR-17 通路
        3.2.7 布魯菌感染后通過NO來調(diào)節(jié)TXNIP的表達(dá)
        3.2.8 iNOS/NO的表達(dá)依賴于布魯菌的Ⅳ分泌系統(tǒng)
        3.2.9 TXNIP在原代細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的表達(dá)
    3.3 討論
第四章 布魯菌通過上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
    4.1 材料和方法
        4.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系
        4.1.2 抗體與相關(guān)試劑
        4.1.3 相關(guān)溶液及試劑配制
        4.1.4 主要儀器設(shè)備
        4.1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)布魯菌感染后巨噬細(xì)胞后HO-1 及相關(guān)蛋白的表達(dá)
        4.1.6 通過Crispr敲除HMOX1(HO-1),Nfe2l2(Nrf2)基因的細(xì)胞系
        4.1.7 菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)布魯菌胞內(nèi)存活
        4.1.8 藥物抑制HO-1 蛋白活性后檢測(cè)布魯菌胞內(nèi)存活
        4.1.9 熒光定量PCR檢測(cè)布魯菌感染HO-1~(+/-)RAW264.7 細(xì)胞后相關(guān)因子變化
        4.1.10 蛋白免疫印跡檢測(cè)抑制或敲除上游相關(guān)分子后HO-1 蛋白表達(dá)
        4.1.11 通過熒光定量PCR,蛋白免疫印跡和ELISA檢測(cè)原代細(xì)胞及小鼠體內(nèi)HO-1表達(dá)變化
        4.1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 布魯菌感染巨噬細(xì)胞后增強(qiáng)HO-1 及相關(guān)蛋白的表達(dá)
        4.2.2 布魯菌通過脂多糖(LPS)來上調(diào)表達(dá)HO-1 及相關(guān)蛋白
        4.2.3 布魯菌通過細(xì)胞內(nèi)AMPK,PI-3K通路來調(diào)節(jié)HO-1 的表達(dá)
        4.2.4 缺失或抑制HO-1,Nrf2 蛋白表達(dá)后減弱布魯菌在巨噬細(xì)胞的存活
        4.2.5 缺失HO-1,Nrf2 后對(duì)布魯菌感染巨噬細(xì)胞后活性氧氮產(chǎn)生的影響
        4.2.6 布魯菌在原代細(xì)胞上調(diào)表達(dá)HO-1 以利于其胞內(nèi)存活
        4.2.7 HO-1 在小鼠體內(nèi)的表達(dá)變化
    4.3 討論
第五章 布魯菌通過上調(diào)PRDX5 蛋白表達(dá)來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
    5.1 材料和方法
        5.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系
        5.1.2 抗體與相關(guān)試劑
        5.1.3 相關(guān)溶液及試劑配制
        5.1.4 主要儀器設(shè)備
        5.1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)布魯菌感染后巨噬細(xì)胞后Prdx5 蛋白表達(dá)
        5.1.6 通過Crispr敲除Prdx5 基因的細(xì)胞系
        5.1.7 菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)布魯菌胞內(nèi)存活
        5.1.8 布魯菌通過減少巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
        5.1.9 布魯菌通過減少巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生來增強(qiáng)其胞內(nèi)存活
        5.1.10 通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)小鼠體內(nèi)Prdx5 表達(dá)變化
        5.1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 布魯菌感染巨噬細(xì)胞后通過LPS增強(qiáng)Prdx5 蛋白的表達(dá)
        5.2.2 缺失Prdx5 后對(duì)布魯菌的胞內(nèi)存活的影響
        5.2.3 布魯菌通過上調(diào)Prdx5 減少巨噬細(xì)胞活性氧氮的產(chǎn)生
        5.2.4 Prdx5 在原代細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的表達(dá)變化
    5.3 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3197689