本文關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)發(fā)掘和性腺發(fā)育相關(guān)基因功能初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)俗稱小龍蝦,是我國重要的經(jīng)濟(jì)蝦類。目前,克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛�？耸显r人工養(yǎng)殖過程中,苗種來源主要是存塘親本自繁后代或者是天然水域捕撈,優(yōu)質(zhì)苗種的缺乏一定程度上約束了整個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。性腺發(fā)育是甲殼動(dòng)物進(jìn)行有性生殖的基礎(chǔ),研究克氏原螯蝦性腺發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制,將有助于了解其性腺發(fā)育過程特征。有關(guān)克氏原螯蝦性腺發(fā)育機(jī)制的分子生物學(xué)研究較少,NCBI的Gen Bank序列數(shù)據(jù)庫中相關(guān)基因的信息也比較匱乏。大量挖掘、獲取克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)基因,具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究結(jié)合高通量測序、RACE、q RT-PCR和Western-blot等技術(shù)對克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)基因的分子調(diào)控機(jī)制展開研究。首先對克氏原螯蝦性腺轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行高通量測序,獲得了大量EST序列。通過分析性腺發(fā)育相關(guān)基因pcna、fox L2和成熟促進(jìn)因子(MPF)在性腺發(fā)育過程中的表達(dá)變化,對其分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步探討。篩選到了大量EST-SSR分子標(biāo)記,為克氏原螯蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位等相關(guān)研究提供參考。主要研究結(jié)果如下:1.克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組高通量測序及分析利用454高通量測序技術(shù),對克氏原螯蝦精巢和卵巢組織文庫進(jìn)行分析,獲得了1,134,993條高質(zhì)量的原始序列,序列平均長度832 bp,總量達(dá)943.84 Mb。原始序列經(jīng)聚類組裝,產(chǎn)生了22,652個(gè)isotigs序列,平均長度為1,921 bp,其中有16,018個(gè)isotigs序列長度大于1000 bp。將拼接得到的isotig序列與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索、比對和功能注釋,在精巢與卵巢比較轉(zhuǎn)錄組文庫中,共發(fā)現(xiàn)了3858個(gè)差異表達(dá)的isotigs序列,其中1,720個(gè)isotigs序列在卵巢中高表達(dá),2138個(gè)isotigs序列在精巢中高表達(dá)。結(jié)合已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)資料,鑒定、篩選出了一大批性腺發(fā)育相關(guān)的候選基因。另外,基于測序產(chǎn)生的大量EST序列篩查到數(shù)量眾多的分子標(biāo)記位點(diǎn)。本研究中構(gòu)建的高質(zhì)量的克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組文庫,可為后續(xù)開展克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)的功能基因研究和分子遺傳育種等提供重要參考。2.克氏原螯蝦EST-SSR分布特征及引物的開發(fā)利用基于克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測序產(chǎn)生的22,652個(gè)EST序列,檢索到6,724個(gè)SSRs位點(diǎn),平均140 kb序列中出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)。其中二堿基復(fù)類型最多,大約占57.56%,且以AC堿基重復(fù)類型最為豐富。隨機(jī)挑選100個(gè)EST-SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中55對引物可擴(kuò)增出清晰的目的條帶,進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有26對引物具有多態(tài)性,占可擴(kuò)增出產(chǎn)物引物的47%。用克氏原螯蝦盱眙群體檢測其中8對引物的多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)8對引物的等位基因數(shù)(NA)介于3~11之間;觀測雜合度(HO)介于0.333~0.708之間;期望雜合度(HE)介于0.325~0.806之間;8對微衛(wèi)星引物中有7對顯示出較高的多態(tài)信息含量(PIC0.5)。本研究中篩選的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記可用于克氏原螯蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位等相關(guān)研究。3.克氏原螯蝦不同組織及發(fā)育時(shí)期內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)選取8個(gè)甲殼動(dòng)物中常用內(nèi)參基因ACTB、GAPDH、EF-1α、UB、TUB、TBP、EIF和18S,分析其在克氏原螯蝦組織分布組(眼柄、鰓、肝胰腺、心臟、腸、肌肉、精巢、卵巢)和卵巢發(fā)育組(未發(fā)育期、發(fā)育早期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期、成熟期、產(chǎn)卵后期)中的表達(dá)水平,并結(jié)合常用的統(tǒng)計(jì)方法ge Norm、Best Keeper和Norm Finder對這些內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性做出評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,EIF與18S在克氏原螯蝦不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性最高,TBP和EIF在克氏原螯蝦卵巢發(fā)育不同時(shí)期中的表達(dá)穩(wěn)定性最高,EF-1α和UB在克氏原螯蝦不同組織及卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性均較差。本研究的結(jié)果可以為克氏原螯蝦及其他甲殼動(dòng)物相關(guān)基因定量研究中內(nèi)參基因的選擇提供參考。4.克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析從克氏原螯蝦卵巢組織中成功克隆了pcna、fox L2、cyclin B和cdc2基因c DNA序列全長,分別為:1387 bp、1771 bp、2589 bp和1620 bp,開放閱讀框分別編碼260個(gè)、339個(gè)、402個(gè)和299個(gè)氨基酸�？耸显rpcna基因具有真核生物pcna基因特有的3個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域,與中國對蝦的同源性高達(dá)93%。熒光定量和Western blot結(jié)果顯示,在卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他組織,且在卵巢發(fā)育早期卵母細(xì)胞大量增殖時(shí)的表達(dá)量最高,暗示其在克氏原螯蝦卵細(xì)胞增殖過程起重要作用,可通過測定其表達(dá)量的增加與否來推斷卵巢是否進(jìn)入發(fā)育期;克氏原螯蝦fox L2基因具有FOX家族特有的保守叉頭框區(qū)域,3個(gè)α螺旋和2個(gè)β鏈形成的翼狀結(jié)構(gòu),N端的氨基酸序列相對不保守,C端有一個(gè)細(xì)胞核定位信號(hào)。定量結(jié)果顯示,fox L2基因在主要在克氏原螯蝦的卵巢中表達(dá),而在其他組織中表達(dá)量較低。且在卵黃發(fā)生期達(dá)到最高,表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期,推測fox L2基因在克氏原螯蝦卵巢發(fā)育過程中有重要作用,可能參與了卵黃的形成過程;克氏原螯蝦cyclin B基因具有周期蛋白特有的破壞框、周期蛋白盒和AMP依賴磷酸化位點(diǎn),克氏原螯蝦cdc2基因具有蛋白激酶特有的GXGXXGXV、PSTAIRE和DFG結(jié)構(gòu)域。定量結(jié)果顯示,cyclin B和cdc2基因表達(dá)特征相似,均表現(xiàn)出在卵巢中高表達(dá),在精巢或者其他組織中的表達(dá)量較低。在卵巢發(fā)育過程中,主要在卵巢發(fā)育早期和成熟期有較高的表達(dá),推測cyclin B和cdc2在克氏原螯蝦卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生過程起重要作用,包括卵巢發(fā)育早期的卵原細(xì)胞增殖過程及卵巢成熟期的減數(shù)分裂過。
【關(guān)鍵詞】：克氏原螯蝦 轉(zhuǎn)錄組 454高通量測序 性腺 內(nèi)參基因 EST-SSR
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 引言14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-22
• 1. 克氏原螯蝦簡介15-18
• 2. 高通量測序在蝦蟹類轉(zhuǎn)錄組中的應(yīng)用18-20
• 3. 蝦蟹類性腺發(fā)育相關(guān)基因研究20-21
• 4. 本研究的目的、方法和意義21-22
• 第二章 克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組高通量測序及分析22-36
• 1. 材料與方法22-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 1.2 所用儀器設(shè)備22
• 1.3 主要試劑22-23
• 1.4 RNA的提取和檢測23
• 1.5 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建與測序23-25
• 1.6 序列拼接25-26
• 1.7 功能注釋、基因分類和代謝通路分析26
• 1.8 SSR和SNP查找和分析26
• 2. 結(jié)果與討論26-36
• 2.1454 測序和序列拼接組裝26-28
• 2.2 轉(zhuǎn)錄組序列的功能注釋28-29
• 2.3 GO功能分類和KEGG代謝途徑29-32
• 2.4 性腺發(fā)育相關(guān)基因篩選32-35
• 2.5 SSR和SNP標(biāo)記的鑒定35-36
• 第三章 克氏原螯蝦EST-SSR分布特征及引物開發(fā)利用36-43
• 1. 材料與方法36-38
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 1.2 所用儀器設(shè)備37
• 1.3 主要試劑37
• 1.4 基因組DNA提取37
• 1.5 EST-SSR引物的篩選37-38
• 1.6 EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析38
• 2. 結(jié)果與分析38-41
• 2.1 克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組EST-SSR特征分析38-39
• 2.2 多態(tài)性引物的篩選39-40
• 2.3 EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析40-41
• 3. 討論41-43
• 第四章 克氏原螯蝦不同組織及發(fā)育時(shí)期內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)43-56
• 1. 材料和方法44-47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 1.2 所用儀器設(shè)備44
• 1.3 主要試劑44
• 1.4 RNA提取及cDNA合成44-45
• 1.5 內(nèi)參基因篩選及引物設(shè)計(jì)45-46
• 1.6 實(shí)時(shí)定量PCR46
• 1.7 數(shù)據(jù)分析46
• 1.8 vg基因的表達(dá)特征46-47
• 2 結(jié)果與分析47-54
• 2.1 引物擴(kuò)增效率及特異性47-48
• 2.2 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)48-52
• 2.3 不同內(nèi)參基因校正后的vg表達(dá)量52-54
• 3. 討論54-56
• 第五章 克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析56-107
• 第一節(jié) 克氏原螯蝦pcna基因的克隆與表達(dá)分析57-78
• 1. 材料和方法57-70
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料57-58
• 1.2 所用儀器設(shè)備58
• 1.3 主要試劑58
• 1.4 克氏原螯蝦pcna基因cDNA全長的克隆58-62
• 1.5 生物信息學(xué)分析62-63
• 1.6 克氏原螯蝦pcna基因的表達(dá)分析63-64
• 1.7 克氏原螯蝦pcna基因的原核表達(dá)及抗體制備64-70
• 2. 結(jié)果與分析70-76
• 2.1 克氏原螯蝦pcna基因結(jié)構(gòu)分析70-72
• 2.2 多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析72-74
• 2.3 克氏原螯蝦pcna基因的表達(dá)特征74-75
• 2.4 重組蛋白表達(dá)及檢測75-76
• 2.5 各組織總蛋白Western blot檢測76
• 3. 討論76-78
• 第二節(jié) 克氏原螯蝦foxL2 基因的克隆與表達(dá)分析78-90
• 1. 材料和方法78-82
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料78-79
• 1.2 所用儀器設(shè)備79
• 1.3 主要試劑79
• 1.4 克氏原螯蝦foxL2 基因基因cDNA全長的克隆79-81
• 1.5 生物信息學(xué)分析81-82
• 1.6 克氏原螯蝦foxL2 基因的表達(dá)分析82
• 2. 結(jié)果與分析82-88
• 2.1 克氏原螯蝦foxL2 基因結(jié)構(gòu)分析82-83
• 2.2 多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析83
• 2.3 克氏原螯蝦foxL2 基因的表達(dá)特征83-88
• 3. 討論88-90
• 第三節(jié) 克氏原螯蝦cyclinB基因和cdc2 基因的克隆與表達(dá)分析90-107
• 1. 材料和方法90-95
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料90-91
• 1.2 所用儀器設(shè)備91
• 1.3 主要試劑91
• 1.4 克氏原螯蝦cyclin B和cdc2 基因cDNA全長的克隆91-94
• 1.5 生物信息學(xué)分析94
• 1.6 克氏原螯蝦cyclin B和cdc2 基因的表達(dá)分析94-95
• 2. 結(jié)果與分析95-105
• 2.1 克氏原螯蝦cyclin B和cdc2 基因結(jié)構(gòu)分析95-100
• 2.2 多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析100-104
• 2.3 克氏原螯蝦cyclin B和cdc2 基因的表達(dá)特征104-105
• 3. 討論105-107
• 結(jié)論107-108
• 參考文獻(xiàn)108-121
• 附錄一 縮略詞121-123
• 附錄二 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及產(chǎn)地123-124
• 附錄三 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文124-125
• 致謝125

  本文關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)發(fā)掘和性腺發(fā)育相關(guān)基因功能初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：314058