本文關(guān)鍵詞：文昌魚CAL和斑馬魚PTX的晶體結(jié)構(gòu)與進(jìn)化機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：獲得性免疫系統(tǒng)—以多樣性的抗原受體(BCRs和TCRs)、淋巴細(xì)胞、各種重組機(jī)制為特征一起源于5億年前的軟骨魚。迄今為止,由于經(jīng)典獲得性免疫系統(tǒng)的所有組分都發(fā)現(xiàn)于有頜類及以后的物種,使得探討以TCR-BCR為基礎(chǔ)的獲得性免疫系統(tǒng)的起源成為了一個難題。然而,BCRs和TCRs共同具有的抗原識別功能域,即免疫球蛋白超家族功能域V (IgSF-V)、同樣的重組機(jī)制及其最低等有頜脊椎動物如鯊魚基因組中的緊密連鎖、使進(jìn)化學(xué)者達(dá)成了基本共識：BCRs和TCRs共同起源于更低等脊索動物中的一個具有IgSF功能域的祖先基因。聚焦于脊椎動物的祖先—頭索動物文昌魚,其全基因組測序于2008年完成,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)它是全基因組2次復(fù)制前公認(rèn)的、最古老的活化石物種。因此,在文昌魚中尋找IgSF-V分子,解析其結(jié)構(gòu)、分析相關(guān)功能,既可反映出IgSF共同祖先分子(CAL)的特征,又可獨(dú)辟蹊徑的闡釋獲得性免疫系統(tǒng)的起源。 短鏈五聚素(PTX)為非特異免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子,其功能類似于抗體,既能與Clq結(jié)合、通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng),又能與FcR結(jié)合引發(fā)免疫溶菌和調(diào)理吞噬效率。斑馬魚具有上述分子和細(xì)胞,是研究PTX在低等脊椎動物中的結(jié)構(gòu)及其與特異性免疫分子之間互作機(jī)制的最好對象。因此,本文對文昌魚CAL和斑馬魚PTX兩個進(jìn)化節(jié)點(diǎn)相關(guān)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,并集成了生物信息學(xué)、分子免疫學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)對其功能進(jìn)行了闡釋。 首先,在文昌魚基因組和轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了-IgSF-V共同祖先樣分子CAL。解析其基因組構(gòu)造發(fā)現(xiàn),CAL位于文昌魚免疫功能相關(guān)基因域,令人驚訝的是在CAL的內(nèi)含子2、3和4中均存在RSS-like序列,并且,其跨膜區(qū)域存在保守的抗原受體跨膜區(qū)序列(CART motif)。隨后,對CAL進(jìn)行了表達(dá)、純化與結(jié)晶。CAL晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示,CAL蛋白由兩個獨(dú)立的lg功能域組成,形成了一個IgV和IgC串聯(lián)的結(jié)構(gòu),這是迄今為止解析的最古老的IgV-C分子。CAL具備典型的獲得性免疫受體的結(jié)構(gòu)特征—典型的IgV結(jié)構(gòu)域、多樣性的CDR-loop、J鏈樣基序和結(jié)構(gòu)(β-bulge)及3-layer packing的二聚體方式等。組織定位顯示,CAL主要在原始的鰓、腸道和肝盲囊表達(dá),并且都位于易于與外界微生物接觸的腔面。腸道亞細(xì)胞定位顯示,CAL主要分布在纖毛、細(xì)胞表面凸起、分泌性顆粒等具有免疫功能的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 另外,通過解析斑馬魚PTX (Dare-PTX)及Dare-PTX-Ca的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Dare-PTX是一個三聚體,其結(jié)構(gòu)是在五聚素家族中發(fā)現(xiàn)的一新聚合方式。與人PTX相比,在Dare-PTX的配體識別面,Dare-PTX具有深而窄的抗原結(jié)合口袋。在Dare-PTX的效應(yīng)面,Dare-PTX具有一個新的C1q的結(jié)合模式及部分保守的FcR的結(jié)合位點(diǎn)。 綜上所述,本文通過對CAL的研究,發(fā)現(xiàn)了文昌魚體內(nèi)存在一個與免疫相關(guān)的具有體細(xì)胞突變的IgV-C分子,其精細(xì)結(jié)構(gòu)具有獲得性免疫受體的典型結(jié)構(gòu)特征,并具備免疫受體的基因組元件。結(jié)果將有助于我們更好地理解獲得性免疫的起源與進(jìn)化。斑馬魚PTX的結(jié)構(gòu)展示了一個起源于4.5億年前的硬骨魚的PTX精細(xì)結(jié)構(gòu)及其獲得性免疫系統(tǒng)的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：共同的祖先樣分子 短鏈五聚素 獲得性免疫受體 進(jìn)化 晶體結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 目錄7-10
• 插圖和附表清單10-13
• 縮略詞表13-15
• 第一章 引言15-38
• 1 國內(nèi)外研究進(jìn)展15-36
• 1.1 免疫進(jìn)化領(lǐng)域的研究進(jìn)展15-27
• 1.2 文昌魚的進(jìn)化地位與其免疫學(xué)的研究現(xiàn)狀27-31
• 1.3 短鏈五聚素PTX的研究進(jìn)展31-36
• 2 研究目的與意義36-37
• 3 研究內(nèi)容和技術(shù)路線37-38
• 3.1 研究內(nèi)容37
• 3.2 技術(shù)路線37-38
• 第二章 CAL分子的基因組構(gòu)造與體細(xì)胞突變解析38-55
• 1 引言38-39
• 2 材料39-41
• 2.1 文昌魚39
• 2.2 載體與菌株39
• 2.3 常規(guī)分子生物學(xué)試劑39
• 2.4 主要儀器設(shè)備39
• 2.5 常用溶液及配制39-41
• 3 方法41-45
• 3.1 CAL分子的基因構(gòu)造與生物信息學(xué)分析41-42
• 3.2 文昌魚總RNA的提取42
• 3.3 CAL分子克隆42-45
• 4 結(jié)果45-53
• 4.1 CAL基因在佛羅里達(dá)文昌魚基因組的構(gòu)造45-46
• 4.2 CAL的生物信息學(xué)分析46-49
• 4.3 CAL在中國文昌魚的體細(xì)胞突變解析49-53
• 5 討論53-54
• 5.1 CAL的基因組構(gòu)造53
• 5.2 CAL的體細(xì)胞突變機(jī)制53-54
• 6 小結(jié)54-55
• 第三章 文昌魚CAL分子晶體結(jié)構(gòu)研究55-83
• 1 引言55-56
• 2 材料56-62
• 2.1 CAL基因合成56
• 2.2 載體與菌株56
• 2.3 常規(guī)分子生物學(xué)試劑56
• 2.4 主要儀器設(shè)備56-57
• 2.5 常用溶液及配制57-62
• 3 方法62-67
• 3.1 CAL/pET21a表達(dá)載體的構(gòu)建62
• 3.2 CAL分子的表達(dá)62-63
• 3.3 CAL-V基因的亞克隆與表達(dá)63-64
• 3.4 CAL和CAL-V包涵體的提取64
• 3.5 CAL和CAL-V的復(fù)性與純化64-65
• 3.6 CAL和CAL-V的蛋白結(jié)晶65-66
• 3.7 CAL和CAL-V結(jié)構(gòu)的分析66-67
• 4 結(jié)果67-81
• 4.1 CAL和CAL-V表達(dá)載體的構(gòu)建67-68
• 4.2 CAL和CAL-V的純化68-70
• 4.3 CAL和CAL-V的結(jié)晶70
• 4.4 CAL和CAL-V晶體的衍射及結(jié)構(gòu)解析70-71
• 4.5 CAL和CAL-V結(jié)構(gòu)分析71-81
• 5 討論81-82
• 6 小結(jié)82-83
• 第四章 文昌魚CAL分子的組織及亞細(xì)胞定位83-92
• 1 引言83-84
• 2 材料84-85
• 2.1 文昌魚84
• 2.2 鼠抗CAL的單克隆抗體制備84
• 2.3 常規(guī)分子生物學(xué)試劑84
• 2.4 主要儀器設(shè)備84
• 2.5 常用溶液及配制84-85
• 3 方法85-87
• 3.1 CAL蛋白及其單抗的純化85
• 3.2 CAL的組織定位85
• 3.3 CAL的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位85-87
• 4 結(jié)果87-90
• 4.1 抗CAL的單克隆抗體的純化87
• 4.2 CAL的組織定位及腸道的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位87-90
• 5 討論90-91
• 6 小結(jié)91-92
• 第五章 斑馬魚CRP晶體結(jié)構(gòu)研究92-121
• 1 引言92-93
• 2 材料93
• 2.1 斑馬魚93
• 2.2 載體、菌株、試劑與試劑盒93
• 2.3 主要儀器設(shè)備93
• 2.5 常用試劑及配制方法93
• 3 實(shí)驗(yàn)方法93-96
• 3.1 Dare-PTX分子的克隆93-94
• 3.2 Dare-PTX 的表達(dá)94
• 3.3 Dare-PTX蛋白的復(fù)性及純化94
• 3.4 Dare-PTX蛋白的結(jié)晶94-95
• 3.5 Dare-PTX分子結(jié)構(gòu)的解析95
• 3.6 Dare-PTX蛋白的分析超速離心95-96
• 4. 結(jié)果96-117
• 4.1 Dare-PTX的克隆96-97
• 4.2 Dare-PTX的表達(dá)97-100
• 4.3 Dare-PTX的純化100
• 4.4 Dare-PTX的分析超速離心100-101
• 4.5 Dare-PTX的結(jié)晶101-102
• 4.6 Dare-PTX和Dare-PTX-Ca的結(jié)構(gòu)分析102-117
• 5 討論117-120
• 6 小結(jié)120-121
• 第六章 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)121-123
• 1. 結(jié)論121
• 2. 創(chuàng)新點(diǎn)121-123
• 參考文獻(xiàn)123-131
• 致謝131-133
• 個人簡歷133-134

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：312443