本文關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉—細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗的研制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病,通過牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引發(fā)的牛群間的一種常發(fā)、多見的傳染病。該病主要臨床特征可發(fā)生牛群的持續(xù)性感染,表現(xiàn)為犢牛腹瀉,成牛多發(fā)性黏膜病,同時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制,母畜流產(chǎn)等癥狀。牛細(xì)小病毒病是由牛細(xì)小病毒(Bovine parvovirus,BPV)引起,可以在牛群相互接觸時(shí)進(jìn)行傳播的一種重要的傳染病。該病主要臨床特征是妊娠母牛發(fā)生流產(chǎn)和新生犢牛發(fā)生呼吸道和消化道等病癥。在美國(guó)各類獸用疫苗中排在前十位的產(chǎn)品中有9個(gè)產(chǎn)品為多價(jià)或多聯(lián)疫苗,多聯(lián)苗在國(guó)外牛用疫苗備受關(guān)注,同時(shí)也是發(fā)展方向。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)牛病毒性腹瀉、牛細(xì)小病毒病的二聯(lián)疫苗的研制報(bào)道。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)法分離到兩株牛細(xì)小病毒,建立牛細(xì)小病毒株、牛病毒性腹瀉病毒株疫苗開發(fā)用毒種種子批,并且對(duì)毒種種子批是否存在內(nèi)外源因子污染,兩個(gè)毒株在不同細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)及毒株的免疫原性進(jìn)行研究。牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗工藝研究方面,通過對(duì)病毒培養(yǎng)過程的工藝參數(shù)、病毒收獲液的滅活條件等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,確定了疫苗的制備工藝參數(shù)。最后對(duì)疫苗進(jìn)行了效力和安全檢查,證實(shí)通過上述工藝制備的疫苗是安全和有效。首先本研究從國(guó)內(nèi)牛血清中成功分離獲得兩株牛細(xì)小病毒,分別命名NB0801、NB1202。這兩株牛細(xì)小病毒均具有凝集豚鼠?馬?人的紅細(xì)胞的特性。使用Reed-Muench法進(jìn)行病毒毒力測(cè)定,NB0801、NB1202兩株牛細(xì)小病毒的毒力分別達(dá)到1.5×106TCID50/ml、1.2×109TCID50/ml,本實(shí)驗(yàn)保存的NM0901株牛病毒性腹瀉病毒的毒力為1.6×107 TCID50/ml。建立了NB1202株、NM0901株疫苗開發(fā)用毒種庫(kù),對(duì)毒種庫(kù)進(jìn)行了內(nèi)外源因子檢測(cè)及毒種免疫原性方面的研究。內(nèi)外源因子檢測(cè)結(jié)果顯示牛細(xì)小病毒NB1202株、牛病毒性腹瀉病毒NM0901株無(wú)內(nèi)外源因子污染。毒種免疫原性結(jié)果顯示:牛細(xì)小病毒NB1202株體外抗體中和效價(jià)達(dá)到1:160,牛病毒性腹瀉病毒NM0901株體外抗體中和效價(jià)達(dá)到1:40,證實(shí)兩個(gè)毒株均具備較好的免疫原性。通過牛細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉病毒在不同細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)的研究。最終確定:牛陀螺狀細(xì)胞(Bovine turbinate cells,BT)細(xì)胞株作為牛細(xì)小病毒疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞,馬-達(dá)氏牛腎細(xì)胞(Madin-Darby Bovine Kidney Cells,MDBK)作為牛病毒性腹瀉病毒疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞。結(jié)果顯示:NB1202株、NM0901株毒種庫(kù)符合牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗的研發(fā)使用。牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗工藝研究方面,對(duì)牛細(xì)小病毒NB1202株、牛病毒性腹瀉病毒NM0901株在3L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中,不同溫度參數(shù)、不同接毒劑量與病毒增殖的相關(guān)性進(jìn)行研究。確定牛細(xì)小病毒NB1202株、牛病毒性腹瀉病毒NM0901株在3L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中的最適培養(yǎng)溫度參數(shù)和病毒接種量。通過甲醛滅活驗(yàn)證試驗(yàn),確定甲醛滅活最適宜濃度為0.7mg/ml。通過鋁佐劑劑量的篩選試驗(yàn),確定氫氧化鋁佐劑的最佳用量為1mg/ml。通過上述實(shí)驗(yàn)研究,優(yōu)化了牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗的制備工藝。本研究在疫苗安全性評(píng)價(jià)方面,同時(shí)使用SPF級(jí)小鼠法和豚鼠法進(jìn)行牛病毒性腹瀉-牛細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗牛病毒性腹瀉疫苗的安全檢查。結(jié)果證明本研究制備的疫苗安全性符合要求。在疫苗有效性評(píng)價(jià)方面,本研究建立了一種SPF級(jí)小鼠法檢測(cè)牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗效力方法。該方法是以白喉疫苗效力試驗(yàn)(Vero細(xì)胞法)為基礎(chǔ),建立了用于牛病毒性腹瀉-牛細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗效力檢測(cè)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于,以抗體檢測(cè)代替了動(dòng)物攻毒試驗(yàn),具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。牛病毒性腹瀉-牛細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)結(jié)果顯示:牛病毒性腹瀉疫苗原液效價(jià)可達(dá)到1:80,牛細(xì)小病毒病疫苗原液效價(jià)可達(dá)到1:160,表明疫苗具有良好的保護(hù)性。上述研究成果對(duì)我國(guó)牛病毒性腹瀉、牛細(xì)小病毒病的防控提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牛病毒性腹瀉病毒 牛細(xì)小病毒 病毒分離 疫苗生產(chǎn)工藝 疫苗安全性 疫苗免疫原性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮寫詞表9-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-24
• 第一章 牛病毒性腹瀉研究進(jìn)展12-18
• 1 牛病毒性腹瀉病原學(xué)研究進(jìn)展12-14
• 2 牛病毒性腹瀉流行病學(xué)14-16
• 3 牛病毒性腹瀉疫苗的研究進(jìn)展16-18
• 第二章 牛細(xì)小病毒病研究進(jìn)展18-22
• 1 牛細(xì)小病毒病病原學(xué)18-20
• 2 牛細(xì)小病毒病的流行病學(xué)20-22
• 第三章 研究目的與意義22-24
• 第二篇 實(shí)驗(yàn)研究24-75
• 第一章 牛細(xì)小病毒分離鑒定24-31
• 1 材料24-25
• 2 方法25-27
• 3 結(jié)果27-30
• 4 討論30
• 5 小結(jié)30-31
• 第二章 牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗毒種種子批的檢定31-46
• 1 材料31-33
• 2 方法33-37
• 3 結(jié)果37-45
• 4 討論45
• 5 小結(jié)45-46
• 第三章 牛細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉病毒在不同細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力學(xué)的研究46-55
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 結(jié)果49-53
• 4 討論53-54
• 5 小結(jié)54-55
• 第四章 牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗的生產(chǎn)工藝研究55-70
• 1 材料55-57
• 2 方法57-61
• 3 結(jié)果61-67
• 4 討論67-68
• 5 小結(jié)68-70
• 第五章 牛病毒性腹瀉-細(xì)小病毒病二聯(lián)疫苗安全性和免疫原性評(píng)價(jià)70-75
• 1 材料70-71
• 2 方法71-73
• 3 結(jié)果73
• 4 討論73-74
• 5 小結(jié)74-75
• 結(jié)論75-76
• 參考文獻(xiàn)76-86
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介86-88
• 作者簡(jiǎn)介88-89
• 致謝89

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本文編號(hào)：291222