菊芋(Helianthus tuberosus)是菊科(Asterceae)向日葵屬的多年生草本植物,塊莖富含的菊糖為工業(yè)果糖的重要來源,葉片、塊莖的提取物及分泌物具有抗細菌、抗真菌及抗癌活性。菊芋具有很強的抗逆能力,在土壤改良、荒漠治理及水土保持方面也體現(xiàn)重要的生態(tài)價值,因此菊芋已成為具有經(jīng)濟和生態(tài)雙重價值潛力的重要工業(yè)作物。本文通過植物組織培養(yǎng)技術獲得了菊芋懸浮培養(yǎng)細胞,并以此為研究對象,研究了茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、綠色木霉、AgNO36種誘導子對菊糖(含量、產(chǎn)量及聚合度)和酚類物質(zhì)(總酚、組分)的誘導。(1)通過對菊芋葉片、莖節(jié)及塊莖3種外植體在愈傷組織誘導率、形態(tài)及干重的比較,結合NAA與6-BA和KT的激素組合篩選,確定了菊芋愈傷組織誘導的最佳外植體為莖節(jié),培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。進一步,通過接種量、繼代原液保留量、蔗糖濃度、氮源添加等條件的優(yōu)化,建立了菊芋細胞懸浮培養(yǎng)體系：培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L脯氨酸+1.0 mg/L谷氨酰胺,蔗糖30g/L,接種量4 g/100 mL液體培養(yǎng)基,繼代原液保留量為20 mL。獲得了最佳生長曲線：0-4天為遲滯期,6-18天為對數(shù)生長期,之后為穩(wěn)定期。(2)6種誘導子對菊芋懸浮細胞中菊糖的誘導效果依次為：茉莉酸甲酯(250μmol/L)AgNO3 (10μmol/L)水楊酸(75 μmol/L殼聚糖(40 mg/L)綠色木霉(90 mg/L)酵母提取物(0.25 mg/L),相應的菊糖含量增加了1.43、1.05、0.93、0.76、0.44、0.18倍,相應的菊糖產(chǎn)量分別提高了2.09、3.60、1.26、1.76、1.06、0.09倍。6種誘導子均顯著提高菊芋懸浮細胞中低聚合度(聚合度Dp 2-20)菊糖的比例。茉莉酸甲酯對Dp 2-8的菊糖誘導效果顯著,尤其誘導Dp6菊糖比例由2.17%增加到29.15%。水楊酸顯著誘導增加Dp 2-17菊糖的比例,特別是Dp 2-4菊糖比例分別由8.16%、6.79%、7.17%提高到20.86%、14.79%、18.53%。殼聚糖對Dp4菊糖誘導效果最為顯著,比例由0.51%增加到56.42%。酵母提取物及綠色木霉顯著增加了Dp3和Dp4菊糖的比例,Dp3菊糖比例分別增加到50.78%(對照28.04%)、38.12%(對照22.77),Dp4菊糖比例分別增加到58.83%(對照1.78%)、51.22%(對照32.57%)。AgN03增加了Dp 3-12菊糖比例,其中Dp7菊糖效果最顯著,由0.01%增加到11.15%。結合菊芋懸浮細胞中菊糖含量以及低聚合度菊糖比例確定了6種誘導子的最佳處理濃度和時間為：茉莉酸甲酯(250 μmol/L)6天、水楊酸(75 μmol/L)3天、殼聚糖(40 mmg/L)6天、酵母提取物(0.25 mg/L)12天、綠色木霉(90 mg/L)3天、AgN03(10μmol/L)3天。(3)6種誘導子對菊芋懸浮細胞中總酚誘導效果依次為酵母提取物(1.0 mg/L)AgNO3 (5 μmol/L)綠色木霉(90 mg/L)水楊酸(100 μmol/L)茉莉酸甲酯(300 μmol/L)殼聚糖(80 mg/L),相應的總酚含量增加到2.14、1.91、1.85、1.63、1.56、1.17倍。最佳濃度誘導時間為茉莉酸甲酯12天(2.61倍)、水楊酸6天(1.92倍)、酵母提取物3天(1.19倍),其余3種誘導子隨誘導時間增加細胞中總酚含量顯著降低。6種誘導子對菊芋懸浮細胞中14種酚類物質(zhì)含量均具有顯著影響。茉莉酸甲酯誘導其中5種酚類物質(zhì)含量增加10倍以上,同比其他誘導子4-羥基香豆素含量最多增加了59.69倍。相比其他誘導子水楊酸誘導其中7種酚類物質(zhì)(阿魏酸、水楊酸、3-羥基肉桂酸、兒茶素、沒食子酸、東莨菪內(nèi)酯及原兒茶酸)含量增加最為顯著,分別增加了159.22、106.47、45.14、15.20、7.80、7.06、5.89倍。殼聚糖誘導其中6種酚類物質(zhì)含量增加10倍以上,咖啡酸和芥子酸含量顯著增加了98.88倍、79.50倍。酵母提取物顯著增加了表兒茶素(45.04倍)及綠原酸(37.45倍)的含量,同比4-羥基苯甲酸及槲皮素含量誘導也最顯著。綠色木霉及AgN03雖然誘導增加了菊芋懸浮細胞中各種酚類物質(zhì)含量,但誘導效果低于其他4種誘導子。
【學位單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S632.9
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 菊芋
    1.2 菊芋的生物活性物質(zhì)
        1.2.1 菊糖
        1.2.2 酚類和萜類化合物
    1.3 植物組織培養(yǎng)
        1.3.1 組織培養(yǎng)影響因素
        1.3.2 植物懸浮細胞培養(yǎng)
        1.3.3 菊芋懸浮細胞培養(yǎng)
    1.4 植物生物活性物質(zhì)的誘導
        1.4.1 誘導子
        1.4.2 植物生物活性物質(zhì)的誘導研究現(xiàn)狀
    1.5 本試驗研究的目的及意義
2 菊芋懸浮細胞培養(yǎng)體系建立
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 方法
    2.2 結果與分析
        2.2.1 愈傷組織的誘導
        2.2.2 菊芋懸浮細胞培養(yǎng)體系的建立及優(yōu)化
        2.2.3 菊芋懸浮細胞生長曲線
    2.3 討論
    2.4 本章小結
3 菊芋懸浮細胞中生物活性物質(zhì)含量檢測方法
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 菊糖及酚類物質(zhì)測定方法
        3.1.5 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結果與分析
        3.2.1 菊糖含量測定
        3.2.2 菊糖聚合度測定
        3.2.3 酚類物質(zhì)提取
        3.2.4 酚類物質(zhì)含量及抗氧化性測定
        3.2.5 14種酚類物質(zhì)的LC-MS分析
        3.2.6 14種酚類物質(zhì)的UPLC分析
    3.3 討論
    3.4 本章小結
4 菊芋懸浮細胞中菊糖的誘導
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 方法
    4.2 結果與分析
        4.2.1 誘導濃度對菊芋懸浮細胞生物量的影響
        4.2.2 誘導濃度對菊芋懸浮細胞中菊糖含量、產(chǎn)量及聚合度的影響
        4.2.3 誘導時間對菊芋懸浮細胞生物量的影響
        4.2.4 誘導時間對菊芋懸浮細胞中菊糖含量、產(chǎn)量及聚合度的影響
    4.3 討論
    4.4 本章小結
5 菊芋懸浮細胞中酚類物質(zhì)的誘導
    5.1 材料與方法
        5.1.1 試驗材料
        5.1.2 試劑
        5.1.3 主要儀器
        5.1.4 方法
    5.2 結果與分析
        5.2.1 誘導子對菊芋懸浮細胞總酚的影響
        5.2.2 誘導濃度對菊芋懸浮細胞中14種酚類物質(zhì)含量的影響
        5.2.3 誘導時間對菊芋懸浮細胞中14種酚類物質(zhì)含量的影響
        5.2.4 誘導子對菊芋懸浮細胞總酚抗氧化性的影響
    5.3 討論
    5.4 本章小結
結論
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
致謝

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本文編號：2865431