梨(Pyrus spp)是繼葡萄和蘋果后,世界上第三大溫帶水果。在梨的生產(chǎn)栽培過程中,果實大小是果品分級和果園經(jīng)濟效益的主要決定因素,果實硬度與果實口感、貨架期長短息息相關(guān)。分析影響果實大小、硬度的內(nèi)在原因、掌握基因?qū)麑嵈笮�、硬度的調(diào)控機制對選擇優(yōu)良基因型品種、建立育種計劃、提高果實商品性有很大幫助。本研究以小果型野生杜梨、中果型栽培種香梨和大果型栽培種鴨梨為試驗對象,通過組織解剖學研究了果實細胞大小、數(shù)目與梨果實大小的關(guān)系;利用同源克隆的方法分離了兩個梨fw2.2同源基因,對其進行了生物信息學、亞細胞定位以及表達分析,并在超表達轉(zhuǎn)基因植株中進行了功能驗證;分離了PL同源基因,并對其進行了生物信息學、表達分析及原核表達。為進一步研究控制梨果實大小與硬度的分子機理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.香梨和鴨梨果實單果重、體積生長曲線均為單S型,呈“慢-快-慢”趨勢,杜梨果實在整個生長發(fā)育過程中生長緩慢,果實生長動態(tài)幾乎為一條直線,S型曲線特征不明顯。香梨和鴨梨的縱橫徑生長動態(tài)曲線類似S型,而杜梨縱橫徑生長動態(tài)為緩慢增長的直線。前期香梨和鴨梨果實縱徑生長比橫徑生長快;后期香梨和鴨梨果實橫徑生長要比縱徑生長快,杜梨果實縱橫徑生長速率基本一致且增長緩慢。2.通過對梨果實不同時期縱橫徑切片觀察發(fā)現(xiàn):三個梨品種果肉組織細胞生長動態(tài)大致相似,果肉組織細胞體積在不同時期大小一致,其中香梨和鴨梨果肉組織細胞增大的動態(tài)與果實重量和果實體積的生長動態(tài)基本同步。計算果實細胞數(shù)目發(fā)現(xiàn):梨品種間大小差異是由細胞數(shù)目決定的,而不是細胞體積。3.利用同源克隆方法,通過RT-PCR和RACE技術(shù),成功分離了梨兩個fw2.2同源基因,命名為PbFWL1與PbFWL2。PbFWL1編碼了214個氨基酸,分子量約為24.067 kDa,理論等電點pI為6.25,分子式為C1042H1568N296O316S24;PbFWL2編碼了208個氨基酸,分子量約為23.076 kDa,理論等電點pI為5.67,分子式為C1004H1514N272O311S22,兩個蛋白均為親水性蛋白。PbFWL1與PbFWL2蛋白之間的同源性為82.71%,與番茄FW2.2蛋白的同源性分別為44.39%和44.23%。兩個蛋白都含有PLAC8保守結(jié)構(gòu)域和CCXXXXCPC模序。三個梨品種的PbFWLs cDNA序列完全一致。4.在三個梨品種果實生長發(fā)育過程中,PbFWLs mRNA水平在各個時期總體表現(xiàn)為小果高于大果的趨勢。鴨梨PbFWL1除了在135 DAFB表達量較高,在其余時期的表達量和PbFWL2的表達量均保持在一個很低的水平;杜梨的PbFWL1與PbFWL2表達量均為最高,但是在一些時期和香梨的表達量差異不大。PbFWLs基因表達量的上升與下降沒有特別的規(guī)律,但是在果實細胞分裂時期,PbFWL1與PbFWL2表達量均為杜梨香梨鴨梨,與梨果實大小呈負相關(guān)關(guān)系。5.將PbFWLs基因全長cDNA序列插入到pCAMBIA1304雙元表達載體的BglⅡ與SpeⅠ限制性內(nèi)切酶位點之間,構(gòu)建成瞬時表達載體pCAMBIA1304-PbFWLs。用農(nóng)桿菌介導法將構(gòu)建好的質(zhì)粒導入洋蔥表皮細胞中。熒光共聚焦顯微鏡觀察顯示:在波長為480 nm光源激發(fā)下,含有定位信號肽的pCAMBIA1304-PbFWL1和pCAMBIA1304-PbFWL2都在細胞膜上檢測到了熒光信號,而在細胞核、細胞質(zhì)上未檢測到熒光信號,說明pCAMBIA1304-PbFWLs主要存在于在細胞膜上,可能為膜蛋白。6.構(gòu)建了PbFWLs基因植物超表達載體pCAMBIA1303-PbFWLs,浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,成功獲得PbFWLs轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果發(fā)現(xiàn):PbFWL1過量表達的T2代轉(zhuǎn)基因植株地上部分的組織、器官略比對照植株小,地下部分無明顯差異;PbFWL2過量表達的T2代轉(zhuǎn)基因植株大小與對照植株無差異。7.利用同源克隆方法,通過RT-PCR和RACE技術(shù),分離了香梨PL同源基因,命名為PsPL。PsPL編碼了414個氨基酸,分子量約為45.17 kDa,理論等電點pI為6.78,分子式為C1977H3084N574O604S21,為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白質(zhì)屬于果膠裂解酶家族基因,含有一個右手β螺旋結(jié)構(gòu)與蘋果PL蛋白的同源性最高,達97%8.將PsPL基因全長cDNA序列插入到pET28a(+)原核表達載體的BamHⅠ與HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點之間,構(gòu)建成原核表達載體pET-PsPL。在BL21大腸桿菌內(nèi),經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導,37℃220 rpm 2 h就可以大量表達,且隨著時間的延長,表達的蛋白量差異不大。9.從香梨果實生長發(fā)育后期到貨架期,果實硬度不斷下降;PsPL的表達水平呈先升高后下降的趨勢,沒有和香梨果實軟化同步,推測PsPL可能在香梨完全成熟后才大量表達。
【學位單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S661.2
【部分圖文】：

梨 PbFWLs 和 PsPL 基因的克隆、表達與功能初步分析抑制作用[92]。櫻桃中也分離出了 fw2.2 家族成員基因，其中甜櫻桃中 PavCNR12、PavCNR20 基因可能與果實大小相關(guān)，PavCNR12 還可能與酸櫻桃大小有關(guān)[93]。目前，已有 14 種植物的基因組序列被挖掘出類似番茄 fw2.2 的基因，并以驗證了103 個 FWL 基因[92]。大多數(shù)植物 FWL 蛋白質(zhì)由 100 至 250 個氨基酸構(gòu)成，有些大于 400個氨基酸。FW2.2 蛋白同源物之間氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)了一個高度保守的核心結(jié)構(gòu)域。該核心區(qū)域被分成三個子結(jié)構(gòu)域：1 或 2 個跨膜結(jié)構(gòu)域被兩個半胱氨酸/富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域所包圍。半胱氨酸和脯氨酸殘基的保守區(qū)域，和已知影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸，支撐了 FWL 核心領域三級結(jié)構(gòu)的保守性和其可能行使的關(guān)鍵功能[94]（圖 1-1）。

圖 2-1 不同時期三個品種梨果實生長發(fā)育動態(tài)Fig 2-1 Fruit development. The fruit at different days after full bloom (DAFB) are shown

16左邊 Y 軸顯示為香梨與鴨梨；右邊 Y 軸顯示為杜梨The left Y-axis represent for Korla fragrant pear and Yali pear; The right Y-axis represent for Duli pear圖 2-2 梨果實重量（A）、體積（B）生長發(fā)育曲線Fig 2-2 Fruit growth curves, The increasements of fruit weight (A) and fruit volume (B).2.2.2 梨果實縱、橫徑的生長發(fā)育動態(tài)香梨和鴨梨的縱橫徑生長動態(tài)曲線類似 S 型，杜梨沒有明顯的快速增長時期，縱橫
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本文編號：2863386