家蠶質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)病,是家蠶的一種腸道型病毒病,在養(yǎng)蠶生產(chǎn)上具有較大的危害性,病原是一種具包涵體的多角體病毒。研究家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的microRNA(miRNA)和RNA干涉(RNA Interfering,RNAi),一方面從miRNA途徑探明病毒與宿主的免疫調(diào)控關(guān)系,從而找到miRNAs調(diào)控病毒的靶點;另一方面探索RNAi干擾病毒復(fù)制的可行性,對于家蠶病毒病的分子治療乃至抗病品種的育成具有重要的理論和實際意義。本研究預(yù)測了BmCPV編碼的miRNAs,對其中的兩條進行了生物信息學(xué)分析、鑒定和表達特征檢測,初步探索了對病毒本身基因表達的影響;同時研究了雙鏈短RNA(簡稱dsRNA)對BmCPV-RDRP基因的干擾作用,構(gòu)建了表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體。通過本文研究,為進一步探索miRNAs與家蠶基因組互作的關(guān)系,miRNAs影響宿主的基因的表達,miRNAs與BmCPV病毒各分節(jié)基因相互作用的細致研究等提供重要的參考價值,同時也為培育抗BmCPV家蠶品種提供了技術(shù)依據(jù)�，F(xiàn)將研究匯報如下。1.BmCPV能夠編碼miRNAs。對感染BmCPV的家蠶中腸組織提取總小RNA,通過深度測序建立了小RNA文庫,預(yù)測獲得BmCPV編碼的miRNAs。對其中的兩條miRNAs進行生物信息學(xué)分析、驗證和表達特征檢測。表明兩條miRNA分別為BmCPV基因組RNA第三片段編碼的miR-3(478~497 bp)和第五片段編碼的miR-5(2481~2500bp),大小均為20 bp;在線分析繪制了其二級結(jié)構(gòu)和3-D結(jié)構(gòu);Stem-loop RT-qPCR和Northern blot兩種方法驗證,確認了兩條miRNAs的存在;表達特征檢測進一步表明,miR-3表達量相對較多而miR-5表達較少,家蠶感染BmCPV 5 h后能檢測到病毒編碼的miRNAs,24 h后表達量呈上升趨勢。研究結(jié)果表明BmCPV能夠編碼miRNA,為進一步深入研究BmCPV編碼的miRNAs及其功能奠定了基礎(chǔ)。2.BmCPV編碼的miRNAs對病毒本身基因表達具有調(diào)控作用。家蠶感染病毒后體腔注射過量miR和Inhibition-miR,RT-qPCR檢測病毒基因表達,結(jié)果顯示,過量miR能夠顯著促進病毒部分基因表達。3.dsRNA對BmCPV-RDRP基因的干擾作用。以家蠶質(zhì)型多角體病毒依賴于RNA的RNA聚合酶(BmCPV-RDRP)基因為靶標(biāo),設(shè)計合成三條dsRNA序列,家蠶幼蟲感染病毒后體腔注射dsRNA,RT-PCR檢測靶基因表達。每頭5齡蠶注射4~6 ng/mg劑量的dsRNA,能夠干擾BmCPV-RDRP基因的表達;注射dsRNA后感染病毒的處理區(qū)干擾效率可達93%,而注射dsRNA前感染病毒的干擾效率可達99.9%;同時,檢測BmCPV的二個結(jié)構(gòu)蛋白基因片段(S1、S5),其表達水平隨著RDRP基因表達水平降低而降低,推測dsRNA干擾BmCPV-RDRP基因表達能夠影響病毒的增殖。4.構(gòu)建了表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體。克隆家蠶中腸特異性啟動子P2,構(gòu)建了中間表達載體PBM-P2-dsRNA-eGFP,家蠶細胞瞬時轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測,結(jié)果表明啟動子P2能夠表達dsRNA而形成shRNA(small hairpin RNA);以P2-dsRNA序列為目的基因,基于piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建獲得表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體pig-P2-dsRNA-ploy(A)-eGFP-neo,家蠶細胞轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測表明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體能夠表達dsRNA。
【學(xué)位單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S884.52
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 BmCPV研究進展
    1.2 家蠶抗BmCPV研究進展
    1.3 miRNAs概述
    1.4 病毒編碼的miRNA研究進展
    1.5 RNAi抗病毒研究進展
    1.6 本文主要內(nèi)容
第二章 一般材料與方法
    2.1 一般材料
        2.1.1 生物材料
        2.1.2 工具酶和所用相關(guān)試劑盒
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 核酸引物和測序
        2.1.5 試劑配置
        2.1.6 常用儀器
    2.2 常用方法
        2.2.1 制備感受態(tài)細胞
        2.2.2 DNA連接的反應(yīng)體系
        2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.4 重組質(zhì)粒的篩選
        2.2.5 采用堿裂解法來制備少量質(zhì)粒DNA
        2.2.6 DNA目的片段分離和回收
        2.2.7 PCR擴增技術(shù)
        2.2.8 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.9 提取總RNA
        2.2.10 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA
        2.2.11 定量PCR（Quantitative PCR）
第三章 BmCPV編碼miRNA的分析和鑒定
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試驗材料
        3.2.2 試驗方法
    3.3 試驗結(jié)果與分析
        3.3.1 從感染BmCPV家蠶中腸小RNA文庫中預(yù)測miRNAs
        3.3.2 BmCPV的miRNA生物信息學(xué)分析
        3.3.4 miR靶基因的預(yù)測
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
第四章 BmCPV-miRNA對病毒本身基因表達調(diào)控研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 試驗材料
        4.2.2 試驗方法
    4.3 試驗結(jié)果與分析
        4.3.1 miR-3 和Inhibition-miR-3 對BmCPV基因表達的影響
        4.3.2 miR-5 和Inhibit-miR-5 對BmCPV基因表達的影響
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第五章 dsRNA干擾BmCPV-RDRP基因表達研究
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 試驗材料
        5.2.2 試驗方法
    5.3 試驗結(jié)果與分析
        5.3.1 BmCPV-RDRP基因表達特征
        5.3.2 BmCPV基因檢測引物的驗證
        5.3.3 注射液在家蠶體腔內(nèi)擴散的模擬實驗
        5.3.4 dsRNA對BmCPV-RDRP的干擾效果
        5.3.5 BmCPV-RDRP基因抑制后對病毒基因組其它片段表達的影響
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
第六章 基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的表達dsRNA轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及檢測
    6.1 引言
    6.2 材料和方法
        6.2.1 試驗材料
        6.2.2 試驗方法
    6.3 試驗結(jié)果與分析
        6.3.1 Bm-P2啟動子的克隆和在線分析
        6.3.2 中間載體Bm-P2-dsRNA構(gòu)建及表達效果檢測
        6.3.3 轉(zhuǎn)基因表達載體構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染檢測
    6.4 討論
    6.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和成果
致謝
附錄一 Abbreviations list


本文編號：2861523