山羊乳被譽為“奶中之王”,但部分人群會產(chǎn)生羊乳過敏癥狀,β乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是羊乳過敏的主要過敏原。先前的研究試圖通過許多生化方法對羊乳進(jìn)行加工以降低BLG的致敏性,但同時也會改變?nèi)橹衅渌M分,降低羊乳的營養(yǎng)價值�；虼虬屑夹g(shù)被認(rèn)為是減少甚至消除羊乳中BLG過敏原、徹底解決BLG乳過敏癥最直接的方法。乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是一種轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的鐵離子結(jié)合多功能糖蛋白,具有抗菌、抗病毒、抗炎等免疫調(diào)節(jié)功能。本研究分別利用ZFN和TALEN技術(shù)介導(dǎo)外源hLF基因定點敲入奶山羊BLG位點,生產(chǎn)hLF基因定點敲入BLG位點基因打靶奶山羊,使奶山羊乳汁中過敏原BLG降低的同時在乳汁中增加了外源蛋白hLF,這樣不僅可以平衡乳蛋白成分又可以增強山羊乳的免疫調(diào)節(jié)功能,生產(chǎn)具有更高營養(yǎng)價值的“人源化”山羊乳。研究的主要內(nèi)容如下:1.基因打靶載體的構(gòu)建。以奶山羊血液基因組DNA、人外周血中性粒細(xì)胞cDNA和pVAX1?載體為模板分別擴(kuò)增了877 bp和780 bp的5’和3’同源臂序列、hLF編碼序列和bGH polyA序列,將擴(kuò)增的目的片段測序后先后克隆于含有neo篩選標(biāo)記基因打靶載體骨架ploxp上構(gòu)建了基因打靶載體pG,其中hLF-bGH polyA置于5’同源臂序列的下游,篩選標(biāo)記基因的兩側(cè)含有同向的Loxp位點。將該載體轉(zhuǎn)化可表達(dá)Cre酶的大腸桿菌BM25.8后,提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明打靶載體上的Loxp位點可以有效地去除篩選標(biāo)記基因。以打靶載體pG和pB52T3載體為模板分別擴(kuò)增了BLG5-hLF-bGH polyA、BLG3和loxp-EFα-EGFP-p2A-puro-loxp序列,將擴(kuò)增的目的片段測序后先后克隆于骨架載體pMD-19-T上構(gòu)建了含EGFP和puro雙篩選標(biāo)記的打靶載體pSHQ。2.基因打靶載體功能驗證。將ZFN或TALEN表達(dá)載體與基因打靶載體pG共轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞(goat fetal fibroblasts,GFFs),junction PCR結(jié)果顯示單純轉(zhuǎn)染基因打靶載體pG的細(xì)胞中未能擴(kuò)增出目的條帶,共轉(zhuǎn)染ZFN或TALEN與pG的細(xì)胞中均可擴(kuò)增出目的條帶,表明ZFN與TALEN均可以介導(dǎo)hLF基因定位整合至BLG基因位點,提高基因敲入的效率。將基因打靶載體pG與TALEN質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞,應(yīng)用G418篩選抗性克隆,對G418抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行激素誘導(dǎo),應(yīng)用RT-PCR和western blot對外源基因hLF的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果表明基因打靶載體pG由TALEN介導(dǎo)發(fā)生同源重組后可以實現(xiàn)外源基因hLF的表達(dá)。3.ZFN與TALEN介導(dǎo)hLF定向整合至BLG位點的效率檢測。將ZFN與TALEN表達(dá)載體或mRNA分別與基因打靶載體pG共轉(zhuǎn)染GFFs,應(yīng)用G418篩選抗性克隆,junction PCR、long-range PCR和測序方法鑒定檢測ZFN與TALEN介導(dǎo)hLF定向整合至BLG位點的效率,結(jié)果顯示針對BLG第一外顯子,ZFN與TALEN介導(dǎo)hLF定向整合的打靶效率是:TALEN轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組共篩選到G418抗性克隆996個,陽性克隆數(shù)127個,陽性細(xì)胞克隆率為12.8%;ZFN轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組共篩選到G418抗性克隆832個,陽性克隆數(shù)69個,陽性細(xì)胞克隆率為8.3%;TALEN轉(zhuǎn)染mRNA組共篩選到G418抗性克隆810個,陽性克隆數(shù)73個,陽性細(xì)胞克隆率為9.0%;ZFN轉(zhuǎn)染mRNA組共篩選到G418抗性克隆821個,陽性克隆數(shù)48個,陽性細(xì)胞克隆率為5.8%。TALEN介導(dǎo)的基因敲入效率高于ZFN,轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒組的打靶效率高于轉(zhuǎn)染mRNA組,由于轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒具有隨機(jī)整合的弊端,選擇轉(zhuǎn)染mRNA組的陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行體細(xì)胞核移植。4.體細(xì)胞核移植生產(chǎn)基因打靶克隆奶山羊。將染色體數(shù)為60條,核型正常且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞克隆應(yīng)用于體細(xì)胞核移植,核移植后克隆胚胎的融合率、卵裂率和囊胚率與母本野生型細(xì)胞均沒有顯著差異的細(xì)胞克隆選擇用于生產(chǎn)克隆胚胎并進(jìn)行胚胎移植,共移植受體羊37只,最終生產(chǎn)并存活的轉(zhuǎn)基因羊4只(3只來自TALEN介導(dǎo)組,1只來自ZFN介導(dǎo)組),經(jīng)PCR、測序以及southern blot鑒定,4只轉(zhuǎn)基因奶山羊均為單等位基因敲入的基因打靶克隆奶山羊,測序結(jié)果顯示hLF的編碼序列成功置換至BLG基因的第一外顯子信號肽序列的下游,BLG基因的17 bp基因序列被置換。5.基因打靶奶山羊的繁殖性能分析及乳汁成分檢測。對基因打靶克隆奶山羊的繁殖性能指標(biāo)檢測結(jié)果顯示基因打靶克隆奶山羊均可以正常發(fā)情,發(fā)情周期和發(fā)情時間與野生型奶山羊沒有顯著差異,經(jīng)配種,四只基因打靶奶山羊均正常妊娠,并產(chǎn)下后代,經(jīng)PCR、測序及southern blot鑒定其中一只后代為單等位基因敲入的基因打靶克隆奶山羊,表明通過TALEN介導(dǎo)的靶向基因修飾可以通過遺傳的方式傳遞給后代。基因打靶奶山羊正常產(chǎn)仔后,對其乳汁成分進(jìn)行分析,SDS-PAGE、western blot、Q-PCR等分析結(jié)果顯示基因打靶奶山羊乳汁中外源基因hLF成功表達(dá)且BLG基因表達(dá)下調(diào),其它蛋白成分均未發(fā)生顯著變化。對基因打靶奶山羊乳汁中脂肪、總蛋白、乳糖和干物質(zhì)組成含量分析,結(jié)果顯示與野生型奶山羊乳汁成分相比,各組分均沒有顯著差異。綜上所述,本研究應(yīng)用ZFN與TALEN介導(dǎo)外源基因hLF靶向整合至BLG位點,并且結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)基因打靶克隆奶山羊,完善了應(yīng)用人工核酸酶介導(dǎo)基因敲入方法生產(chǎn)基因編輯克隆動物的技術(shù)體系。此外,基因打靶克隆奶山羊的乳汁中不僅消除了部分BLG蛋白,而且在不破壞乳汁組分的前提下又添加了有益蛋白hLF,為乳制品的營養(yǎng)價值的提高及奶山羊新品種的培育奠定了堅實基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S827
【部分圖文】：

促使 FokI 形成二聚體，才能發(fā)生切割作用(Smith et al. 2000)（圖2-1）。2.2.1.2 ZFN 的構(gòu)建 ZFN 的構(gòu)建方法目前包括模塊組裝法、寡聚文庫構(gòu)建組裝法、上下文依賴組裝法和CompoZr 組裝法。 圖 2-1 鋅指模塊和鋅指核酸酶的結(jié)構(gòu)(Hauschild-Quintern et al. 2013)Fig.2-1 Structure of zinc finger and zinc finger nucleases(Hauschild-Quintern et al. 2013)7

裝法(modular assembly)：模塊組裝法（圖 2-2a）是將預(yù)先篩選好，根據(jù)識別序列的要求，將這些獨立模塊選擇好串聯(lián)到一起，這一到了 ZF 結(jié)構(gòu)可以特異地識別 DNA 序列，沒有考慮到將不同 ZF 模間的連接會影響模塊識別 DNA 的特異性(Isalan et al. 1997)。因此于所使用模塊的質(zhì)量以及模塊之間的互通性，研究表明模塊組裝高的失敗率，Cherie L Ramirez 等(2008a)應(yīng)用模塊組裝法針對 104 對 ZFNs，通過酵母雙雜交的方法檢測與 DNA 結(jié)合的效率，結(jié)果

s 的 DNA 識別密碼與 TALENs 的結(jié)構(gòu)(Mussolino and CALEs 的拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)和與 DNA 堿基之間的連接(Mak ey and contacts between TAL effector repeats and DNA base
【參考文獻(xiàn)】

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1 BAO Lei;CHEN HaiDe;JONG UiMyong;RIM CholHo;LI WenLing;LIN XiJuan;ZHANG Dan;LUO Qiong;CUI Chun;HUANG HeFeng;ZHANG Yan;XIAO Lei;FU ZhiXin;;Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J];Science China(Life Sciences);2014年02期

本文編號：2849351