雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitism, IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起雞的一種高度傳染性呼吸道疾病,IB可以感染所有日齡的雞,能在多種組織細(xì)胞中復(fù)制,引發(fā)呼吸道疾病、腹瀉和產(chǎn)蛋量下降等,給造成養(yǎng)禽生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在這項(xiàng)研究中,通過(guò)制備針對(duì)QX型IBV毒株-Sczy3S1蛋白的單克隆抗體,并用該單克隆抗體對(duì)Sczy3 S1蛋白的抗原表位進(jìn)行定位研究,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)S1蛋白的分子結(jié)構(gòu)和抗原表位結(jié)構(gòu),為研究表位疫苗和基于表位的診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)。本研究首先對(duì)Sczy3 S1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明S1蛋白結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以p-折疊和轉(zhuǎn)角為主,并有少量無(wú)規(guī)則區(qū)域；含有較多的兩親性α-螺旋和p-折疊區(qū)域,柔性區(qū)域和表面可及性區(qū)域,有較好的免疫原性。選擇抗原性較強(qiáng)的區(qū)域81aa-422aa,建立了Sczy3 S1原核表達(dá)載體,進(jìn)行原核表達(dá)。擴(kuò)增其核苷酸序列并克隆至pET-32a(+)載體中,將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32-S1轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21 (DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE檢測(cè)重組表達(dá)蛋白His-S1,成功表達(dá)出了大小約為57.5kDa的重組蛋白。表達(dá)蛋白His-S1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化后,大量表達(dá),用HisTrap FF crude親和層析純化,純化效果達(dá)到90%以上。用BAB L/c鼠抗Sczy3高免血清與重組蛋白His-S1做Western blot分析,結(jié)果表明重組蛋白與鼠抗Sczy3高免血清有較好的反應(yīng)性,可用于針對(duì)S1蛋白單克隆抗體的篩選。利用差速離心法純化IBV Sczy3全病毒作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,并用BALB/c鼠高免血清和BALB/c鼠陰性血清建立ELISA檢測(cè)方法。Sczy3病毒免疫BALB/c鼠4次后,取脾臟與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合,融合的誘導(dǎo)劑為PEG1500,共進(jìn)行3次融合。融合細(xì)胞首先用Sczy3純化病毒為包被抗原ELISA檢測(cè),篩選出Sczy3日性單克隆抗體；Sczy3陽(yáng)性單克隆抗體用重組蛋白His-S1作為包被抗原第二輪His-S1-ELISA檢測(cè),篩選出針對(duì)Sczy3 S1蛋白的陽(yáng)性單克隆抗體。陽(yáng)性單抗用Sczy3和重組蛋白His-S1經(jīng)過(guò)Western blot方法檢測(cè),最終獲得了兩株能夠穩(wěn)定分泌IBV SI蛋白單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株1D5和6A12。用鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒檢測(cè)兩株單克隆抗體均為IgM亞型。與AIV(H5、H9亞型)、NDV ELISA反應(yīng),mAbs1D5和6A12特異性良好。與其他10株IBV毒株ELISA反應(yīng),mAbs 1D5和6A12具有交叉反應(yīng)性,mAb 1D5與CK/CH/SCYA/10I和CK/CH/SCMY/10I的反應(yīng)性低,比6A12交叉反應(yīng)性差。Sczy3的第8代尿囊液病毒接種CEK細(xì)胞,建立Sczy3 CEK細(xì)胞適應(yīng)株Sczy3-C。 Sczy3-C第20代測(cè)定TCID50,結(jié)果為10-5.64/0.2 mL。終點(diǎn)法中和試驗(yàn)測(cè)定mAbs 1D5和6A12的中和性,mAbs 1D5和6A12都具有中和性,mAb 1D5的中和效價(jià)為1：40.6,mAb 6A12的中和效價(jià)為1：44.7。制備出的mAbs 1D5和6A12是針對(duì)Sczy3 S1蛋白的中和性單克隆抗體。為了鑒定制備的mAbs 1D5和6A12在IBV Sczy3 SI蛋白上所對(duì)應(yīng)的表位,將mAb1D5和6A12作為靶分子包被ELISA板,用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行生物淘選。經(jīng)過(guò)3輪淘選,每輪增加Tween-20濃度和降低靶分子包被濃度來(lái)增加篩選強(qiáng)度。兩株單抗均隨機(jī)挑選10個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增和ELISA鑒定,陽(yáng)性噬菌體PCR擴(kuò)增獲得核心序列并測(cè)序。mAbs 1D5和6A12均獲得3條序列,與Sczy3 S1蛋白比對(duì)序列發(fā)現(xiàn)mAb1D5的共有序列與S1蛋白87-PPQGMAW-93一致,mAb 6A12的共有序列與S1蛋白412-IQTRTEP-418一致。同源性分析發(fā)現(xiàn),87-PPQGMAW-93在分屬8個(gè)基因型32株IBV中變異性較大,特別是與CK/CH/LSC/99I-Type、Proventriculus-Type和TW-Type的差異性較大；而412-IQTRTEP-418在8個(gè)基因型中較保守,與JP-Type的差異較大。原核表達(dá)含有抗原表位的S1蛋白短肽pET-se1 (77aa-107aa)和pET-se2 (399aa-424aa),利用mAbs1D5和6A12分別對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示,表達(dá)的融合蛋白pET-se 1可被mAb 1D5特異性識(shí)別,pET-se2可被mAb 6A12特異性識(shí)別,由此表明87-PPQGMAW-93和412-IQTRTEP-418為IBV Sczy3 S1蛋白的兩個(gè)線性中和性B細(xì)胞抗原表位。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了IBV S1蛋白的中和性單克隆抗體庫(kù),從分子水平上闡明了IBVS1蛋白的抗原結(jié)構(gòu),有利于進(jìn)一步了解IBV S1蛋白抗原結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系和遺傳變異機(jī)制,為研究新型表位疫苗和表位診斷方法的建立夯實(shí)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：S852.65
【部分圖文】：

３結(jié)果逡逑３．邋１邋ＩＢＶ邋Ｓ１基因生物信息學(xué)分析逡逑利用ＤＮＡＳｔａｒ中的Ｐｒｏ化ａｎ軟件對(duì)Ｓｃｚｙ３邋Ｓ１蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果如圖２－１。逡逑從圖中可看出，Ｓｃ巧３邋Ｓ１蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)用Ｇａｍｉｅｒ－Ｒｏｂｓｏｎ法和Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ法預(yù)測(cè)逡逑的結(jié)果有所不同，主要體現(xiàn)在Ｐ－折疊和轉(zhuǎn)角區(qū)的結(jié)果上，總體來(lái)說(shuō)，Ｓ１蛋白還是＾心｜３－逡逑折疊和轉(zhuǎn)角區(qū)為主，含有較少ａ螺旋和卷曲區(qū)域；含有較多兩親性ａ螺旋、兩親性目折逡逑疊和柔性區(qū)域；蛋白的親水性區(qū)域較多，抗原指數(shù)較高，集中在Ｈ個(gè)區(qū)域３４－２６８ａａ、逡逑３２８－４２０ａａ和４９７－５４０ａａ；表面可及性較高，有兩個(gè)較高區(qū)域４０２－４％ａａ和５１５－５４０ａａ。逡逑ｆ邐Ｉ邐］邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邋Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邋口邋Ｓ；：邋５逡逑——邐？邋？？—邐？邋ｓ邋－邐＿邋－邋—邐—ｓ—邐？邋？邋？邐－＇ｓ＊邐？ｓ邋■逡逑．占．邐．Ａ。，；．逡逑Ａ邐ｒ邋Ｉ邐栻：！邐Ｉｌｌ邐？－．邋■邋■逡逑＝ＨＨＨｉｆＣＴｉｌ邐Ｂ邋ＩＢＢＩＢＨ邋Ｉ邐１邋ｉｒｓＧ．邋Ｒ與ｏｒ；邋－逡逑５邐１邋１邋１邋！邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋１邋ｉｉ邐ｔＳＷｌＩ邋ｊ邋！邋＞邐■！邋Ｉｌｌ邋ｉ邋Ｉ邋■邐＾邐：逡逑Ｔ邋Ｉ邋ＩＩ邋ＩＩ￣Ｍ３－０—Ｍ－ｉ邐ＨＨＨＨ￣ＩＨ—Ｗｉ－ｉ－ＨＩ￣ｌ－Ｈ￣ｌ－ｆｌ－Ｈ￣Ｈ邋0Ｔｌ，．巧古：萬(wàn)。－巧：ｊｒ逡逑了uk姜－S鎂坼澹儒澹潁疂村澹赍寤璨倘ヒ

本文編號(hào)：2828814