本文關(guān)鍵詞：H9N2禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞的基因表達譜研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒在禽類中長期存在,偶而通過密切接觸感染人類。血管內(nèi)皮細胞被認為在病毒感染時在固有免疫細胞的募集,早期細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。但目前關(guān)于機體對H9N2禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞的相關(guān)研究還很少。 本實驗,我們研究內(nèi)皮細胞是否支持H9N2禽流感病毒的增殖并分析病毒接種內(nèi)皮細胞后細胞的基因表達譜。在第一部分實驗,我們用H9N2禽流感病毒(A/Chicken/Hebei/4/2008)接種人臍靜脈內(nèi)皮細胞,并用空斑形成試驗檢測釋放到細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度。我們發(fā)現(xiàn)病毒接種血管內(nèi)皮細胞后,隨著初始病毒接種量的增加,細胞培養(yǎng)液中細胞釋放的病毒量相應(yīng)的增加,提示H9N2禽流感病毒可在人臍靜脈內(nèi)皮細胞上增殖。 在第二部分實驗,我們分別用感染復數(shù)為5的活病毒和p-丙內(nèi)酯滅活的病毒接種血管內(nèi)皮細胞,并在接種細胞24小時后用基因芯片檢測細胞的基因表達譜�；蛐酒Y(jié)果顯示H9N2禽流感病毒接種血管內(nèi)皮細胞后誘導細胞出現(xiàn)大量基因的差異表達(其中2091個基因表達上調(diào),4209個基因表達下調(diào)),呈現(xiàn)出病毒感染的轉(zhuǎn)錄特征。滅活病毒接種細胞后只誘導細胞出現(xiàn)少量基因的差異表達(總計263個差異表達基因,其中177個基因上調(diào),86個基因下調(diào))。這之后,我們主要關(guān)注三方面細胞轉(zhuǎn)錄水平變化的基因。首先,我們分析了與血管內(nèi)皮細胞自身結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因。這些基因包括凋亡相關(guān)基因,粘附分子基因和緊密連接蛋白基因。通過基因生物學過程富集分析,我們發(fā)現(xiàn)H9N2禽流感病毒感染細胞后誘導317個與細胞凋亡相關(guān)的差異表達基因,提示H9N2禽流感病毒感染對細胞產(chǎn)生了深遠的影響。激活的血管內(nèi)皮細胞表達的粘附分子介導白細胞的粘附和跨內(nèi)皮遷移。我們發(fā)現(xiàn)H9N2禽流感病毒感染細胞后誘導粘附分子基因差異表達(ICAM1基因顯著下調(diào),ICAM4和SELE基因顯著上調(diào))。緊密連接蛋白的變化可能會導致內(nèi)皮滲漏。我們發(fā)現(xiàn)H9N2禽流感病毒感染細胞后顯著下調(diào)緊密連接蛋白基因(OCLN, CLDN1、 CLDN11和CLDN23)。其次,我們分析了促炎性細胞因子基因和趨化因子基因的差異表達情況。流感病毒感染的特征是在肺部募集大量固有免疫細胞并伴有大量促炎性細胞因子和趨化因子的釋放。我們并沒有發(fā)現(xiàn)促炎性細胞因子基因發(fā)生差異表達(包括TNF、ILIA、IL1B、IL6和IL10)。但是我們在H9N2禽流感病毒和滅活病毒接種的細胞中檢測到高表達的趨化因子基因(包括CCL5、CXCL10和CXCL11)。最后我們分析了干擾素基因和干擾素誘導基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的差異表達情況。Ⅰ型干擾素被認為在病毒感染時誘導干擾素誘導蛋白的表達,這其中的一些蛋白具有直接的抗病毒作用。盡管干擾素基因和干擾素蛋白未發(fā)生顯著改變,但基因芯片數(shù)據(jù)顯示H9N2禽流感病毒和滅活病毒接種血管內(nèi)皮細胞后,上調(diào)幅度最高的基因是干擾素誘導基因。這些高表達的干擾素誘導基因可以編碼干擾素誘導蛋白(包括IFIT1、IFIT2、IFIT3和IFIT5),干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM1和IFITM2),2’,5’-寡腺苷酸合成酶(OAS1和OAS2)。另外,值得注意的是滅活H9N2禽流感病毒誘導的干擾素誘導基因上調(diào)幅度比H9N2禽流感病毒誘導的幅度高。這些結(jié)果提示血管內(nèi)皮細胞主要通過H9N2禽流感病毒顆粒與細胞相互作用而較少依賴病毒的復制過程誘導細胞表達干擾素誘導基因。我們推測血管內(nèi)皮細胞內(nèi)有一套不依賴干擾素的抗病毒機制。 在最后一項實驗中,我們發(fā)現(xiàn)在H9N2禽流感病毒感染的血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中加入一定劑量的黃芩苷對病毒的增殖有一定的影響。我們通過基因芯片分析還發(fā)現(xiàn)黃芩苷處理病毒感染的血管內(nèi)皮細胞時,誘導一些與細胞自身生物學過程相關(guān)的基因差異表達及病毒復制相關(guān)基因差異表達,而抗病毒相關(guān)基因未發(fā)生差異表達。 綜上所述,我們的結(jié)果顯示人臍靜脈內(nèi)皮細胞支持H9N2禽流感病毒的增殖,H9N2禽流感病毒和滅活H9N2禽流感病毒作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞都可以誘導細胞顯著上調(diào)干擾素誘導基因和趨化因子基因。另外,我們發(fā)現(xiàn)H9N2禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞后誘導細胞凋亡相關(guān)基因表達并顯著下調(diào)緊密連接蛋白基因。這些數(shù)據(jù)為進一步深入研究H9N2禽流感病毒與血管內(nèi)皮細胞相互作用提供了參考資料。
【關(guān)鍵詞】：H9N2亞型禽流感病毒 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 基因芯片 基因表達譜 黃芩苷
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-13
• 插圖清單13-14
• 插表清單14-15
• 中英文對照縮略詞表15-16
• 第一章 文獻綜述及試驗設(shè)計16-32
• 1.1 A型流感病毒綜述16-20
• 1.1.1 流感病毒的分類與命名16
• 1.1.2 A型流感病毒粒子的結(jié)構(gòu)16-17
• 1.1.3 A型流感病毒基因組及其編碼的蛋白質(zhì)17-19
• 1.1.4 A型流感病毒的復制周期19-20
• 1.2 H9N2亞型禽流感病毒的研究進展20-23
• 1.2.1 H9N2亞型禽流感病毒的流行情況21
• 1.2.2 H9N2亞型禽流感病毒與其它亞型流感病毒之間的關(guān)系21-22
• 1.2.3 H9N2亞型禽流感病毒感染哺乳動物及人類的研究進展22-23
• 1.3 流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞的研究進展23-26
• 1.3.1 血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)與功能23-25
• 1.3.2 病毒感染血管內(nèi)皮細胞研究進展25-26
• 1.3.3 流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞研究進展26
• 1.4 黃芩苷作用及機制研究進展26-27
• 1.4.1 黃芩苷的藥理作用26-27
• 1.4.2 黃芩苷的抗流感病毒的作用27
• 1.5 基因芯片研究進展27-29
• 1.5.1 基因芯片介紹27
• 1.5.2 基因芯片原理27-28
• 1.5.3 基因芯片的分類28
• 1.5.4 基因芯片的應(yīng)用28
• 1.5.5 基因芯片用于流感病毒感染實驗的研究28-29
• 1.6 本課題的提出及意義29-30
• 1.7 試驗設(shè)計30-32
• 第二章 H9N2禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞的研究32-48
• 2.1 引言32
• 2.2 技術(shù)路線32-33
• 2.3 主要實驗材料33-36
• 2.3.1 主要實驗儀器與試劑33-34
• 2.3.2 主要試劑配制34-35
• 2.3.3 病毒株和細胞35-36
• 2.4 實驗方法36-39
• 2.4.1 細胞培養(yǎng)36-37
• 2.4.2 病毒制備37
• 2.4.3 流感病毒滴度的測定37-38
• 2.4.4 H9N2 AIV在HUVECs上的復制動力學檢測38
• 2.4.5 黃芩苷對H9N2 AIV在HUVECs上的復制動力學影響38
• 2.4.6 HUVECs活性的測定38
• 2.4.7 統(tǒng)計學方法38-39
• 2.5 實驗結(jié)果39-45
• 2.5.1 HUVECs傳代培養(yǎng)的特征39
• 2.5.2 H9N2 AIV在HUVECs上的復制情況39-44
• 2.5.3 H9N2 AIV接種HUVECs后細胞活性44
• 2.5.4 黃芩苷對H9N2 AIV在HUVECs上復制動力學的影響44
• 2.5.5 選定基因芯片實驗所需H9N2 AIV的感染復數(shù)和感染時間44-45
• 2.6 討論45-46
• 2.6.1 H9N2 AIV在HUVECs上的增殖特性45
• 2.6.2 黃芩苷對H9N2 AIV在HUVECs上的增殖的影響45-46
• 2.7 小結(jié)46-48
• 第三章 感染H9N2禽流感病毒后血管內(nèi)皮細胞的基因表達譜48-74
• 3.1 引言48
• 3.2 技術(shù)路線48-49
• 3.3 主要實驗材料49-50
• 3.3.1 主要實驗儀器和試劑49
• 3.3.2 基因芯片49-50
• 3.4 實驗方法50-56
• 3.4.1 細胞培養(yǎng)及分組處理50
• 3.4.2 細胞總RNA提取、鑒定及純化50-52
• 3.4.3 細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及純化52-53
• 3.4.4 生物素標記的cRNA的合成、純化及片段化53-54
• 3.4.5 基因芯片雜交、清洗、染色及掃描54
• 3.4.6 基因芯片數(shù)據(jù)處理54-55
• 3.4.7 差異表達基因分析55
• 3.4.8 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測樣品中干擾素α和干擾素β的含量55-56
• 3.4.9 統(tǒng)計學方法56
• 3.5 實驗結(jié)果56-70
• 3.5.1 細胞總RNA提取結(jié)果56-57
• 3.5.2 基因芯片質(zhì)量控制57-58
• 3.5.3 基因芯片散點圖58
• 3.5.4 基因芯片數(shù)據(jù)概況58-64
• 3.5.5 選定基因表達譜分析64-68
• 3.5.6 干擾素α和干擾素β蛋白表達水平68-69
• 3.5.7 其它高表達基因列表69-70
• 3.6 討論70-73
• 3.7 小結(jié)73-74
• 第四章 黃芩苷對H9N2禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞基因表達譜的影響74-80
• 4.1 引言74
• 4.2 技術(shù)路線74-75
• 4.3 主要實驗材料75
• 4.3.1 主要實驗儀器和試劑75
• 4.3.2 基因芯片75
• 4.4 實驗方法75-76
• 4.4.1 細胞培養(yǎng)及分組處理75
• 4.4.2 基因芯片實驗及數(shù)據(jù)處理75
• 4.4.3 統(tǒng)計學方法75-76
• 4.5 實驗結(jié)果76-78
• 4.5.1 差異表達基因結(jié)果76-78
• 4.5.2 差異表達基因的生物學過程分析78
• 4.6 討論78-79
• 4.7 小結(jié)79-80
• 第五章 結(jié)論與創(chuàng)新點80-82
• 5.1 結(jié)論80
• 5.2 創(chuàng)新點80-82
• 參考文獻82-90
• 附錄90-112
• 致謝112-114
• 作者簡歷114

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉建華;吳華;潘玉善;苑麗;苗恩果;胡功政;;黃芩苷和環(huán)丙沙星聯(lián)合對鴕鳥源大腸桿菌的協(xié)同作用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年01期

2 高天蕓;孫玉芹;周娟;洪蓓蓓;丁虹;;黃芩苷對化療藥物所致小鼠免疫低下的調(diào)節(jié)作用[J];中國生化藥物雜志;2007年05期

  本文關(guān)鍵詞：H9N2禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細胞的基因表達譜研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：282308