本文關鍵詞：miR-29家族對奶牛乳腺上皮細胞泌乳調(diào)控機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乳品產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展及人們生活水平的不斷進步,使乳制品消費市場不斷擴大,怎么進一步提升乳產(chǎn)量和優(yōu)化乳品質已經(jīng)成為了當今奶業(yè)研究的重點。微小RNA(mi RNA)是一類重要的轉錄后調(diào)控的非編碼小RNA分子。在動物中,mi RNA與其靶基因的3’UTR區(qū)互補結合時抑制其翻譯或特異性切割靶mRNA使其降解從而調(diào)控基因的表達。mi RNA在個體發(fā)育、細胞增殖、凋亡、分化中發(fā)揮重要作用,不少研究表明mi RNA在哺乳動物乳腺發(fā)育和泌乳中具有重要調(diào)控功能。表觀遺傳作為目前生命科學領域研究的熱點,已有研究證明它在乳蛋白基因的表達及動物乳腺發(fā)育和重塑的過程中具有重要的調(diào)控作用。DNA甲基化作為主要的表觀遺傳修飾方式之一,在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的作用下,Cp G二核苷酸的胞嘧啶環(huán)5'位的氫被S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代變成5'-甲基胞嘧啶,通過這種作用機制在不改變DNA堿基序列的情況下調(diào)控基因在組織和細胞中的表達。在哺乳動物中,DNA甲基轉移酶主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B,其中DNMT3A和DNMT3B具有從頭甲基化活性,不需要母鏈的指導,可在未甲基化的DNA雙鏈上進行甲基化,在基因組DNA甲基化異常的發(fā)生中具有重要的引導作用。DNA甲基化參與許多重要生理及病理現(xiàn)象的調(diào)控,有研究表明在奶牛乳腺中DNA甲基化與乳蛋白基因的表達調(diào)節(jié)密切相關,這就為乳腺發(fā)育、泌乳功能機理研究提供了新的方向。mi RNA對DNA甲基化模式的調(diào)控多數(shù)集中在腫瘤等疾病的研究上,在奶牛乳腺中還鮮見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)mi RNA在高、低乳品質奶牛乳腺組織中的表達具有顯著差異,在高乳品質奶牛乳腺組織中上調(diào)的mi RNAs中,mi R-29s家族(mi R-29a、mi R-29b、mir-29c)與在DNA甲基化中起關鍵作用的DNA甲基化酶DNMT3A和DNMT3B的3'UTR有互補序列,mi R-29s是否能通過調(diào)控制DNA的甲基化進而影響奶牛乳腺發(fā)育和泌乳功能就成為了我們研究的重點。本研究以本實驗室原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞(DCMECs)為模型,通過脂質體轉染法在細胞中轉染mi R-29s mimics/inhibitor,首先利用雙熒光素酶活性檢測及綠色熒光蛋白GFP表達檢測進行了mi R-29s靶基因的驗證;應用實時熒光定量及Western blotting技術檢測DNMT3A/3B及泌乳相關基因表達的變化;采用重亞硫酸鹽測序技術(BSP)分析了泌乳相關基因的啟動子甲基化的改變;通過細胞中添加甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dc后觀察了泌乳相關基因及mi R-29s表達的變化;使用CASY細胞活力分析儀檢測活細胞數(shù)和細胞活力的變化;應用Ed U標記技術檢測了對細胞增殖的影響;同時使用酪蛋白檢測試劑盒、TG檢測試劑盒和乳糖檢測試劑盒檢測了細胞分泌?-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的能力。實驗結果表明:(1)實時熒光定量PCR檢測結果與小RNA測序結果基本一致,顯示高乳品質奶牛乳腺組織中mi R-29s的表達與低乳品質及非泌乳奶牛乳腺組織相比均顯著升高(P0.05)。(2)靶基因驗證實驗表明,在奶牛乳腺上皮細胞中,DNMT-3A/-3B是mi R-29s的靶基因,mi R-29s能通過負調(diào)控DNMT3A/3B的表達降低細胞基因組DNA總體甲基化水平(GDM)及甲基轉移酶的活力。(3)熒光定量PCR及Western Blotting檢測結果顯示,mi R-29s能影響奶牛乳腺上皮細胞中泌乳相關基因m RNA及蛋白的表達。過表達mi R-29s時奶牛乳腺上皮細胞中的AKT1、m TOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1、PPARγ、GLUT1表達量均顯著下降;抑制內(nèi)源性mi R-29s表達時,細胞內(nèi)AKT1、mTOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1、PPARγ、GLUT1的表達均升高;推測mi R-29s對乳成分的合成及分泌具有重要的調(diào)控作用。(4)重亞硫酸鹽測序結果表明,在奶牛乳腺上皮細胞中沉默mi R-29b時,Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平均有明顯的升高,而Akt1及m TOR啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平?jīng)]有明顯變化。5-Aza-dc處理奶牛乳腺上皮細胞后,熒光定量PCR檢測Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1、Akt1、m TOR mRNA的表達,發(fā)現(xiàn)5-Aza-dc處理組與空白對照組相比Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1的mRNA表達顯著升高,Akt1、m TOR m RNA的表達無顯著變化。實驗結果表明mi R-29s主要通過調(diào)控DNA甲基化模式影響泌乳重要基因Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1的表達,對Akt1、m TOR的調(diào)控機制還需要進一步研究。(5)用5-Aza-dc處理奶牛乳腺上皮細胞后,與空白對照組相比mi R-29a、mi R-29c的表達變化并不明顯,mi R-29b的表達顯著升高。重亞硫酸鹽測序結果表明,與空白對照組相比,mi R-29b啟動子區(qū)域甲基化明顯升高。結果表明在奶牛乳腺上皮細胞中mi R-29b的表達受到DNA甲基化水平的調(diào)控。(6)應用CASY及Ed U標記技術發(fā)現(xiàn),mi R-29s對奶牛乳腺上皮細胞的活力、細胞增殖均具有促進作用。檢測奶牛乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白(CSN2)、乳糖及甘油三酯的結果表明,超量表達mi R-29a、-29b、-29c能促進乳蛋白、乳脂及乳糖的合成;沉寂mi R-29s對奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的分泌均有抑制作用,且5-Aza-dc能恢復或部分逆轉mi R-29s抑制子對乳成分合成的抑制作用,提示mi R-29s對奶牛乳腺泌乳的調(diào)控與DNA甲基化作用密切相關。綜上,mi R-29a、mi R-29b、mi R-29c為乳腺泌乳調(diào)控網(wǎng)絡中的成員,通過調(diào)控其靶基因Dnmt3a/3b的表達影響奶牛乳腺上皮細胞DNA甲基化水平。泌乳相關基因啟動子區(qū)域DNA甲基化水平的改變能引起基因表達的變化,進而影響乳腺細胞的增殖和乳成分的生成及分泌。mi R-29s通過調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞DNA甲基化參與乳腺泌乳調(diào)控的作用機制的闡明為今后奶牛業(yè)乳品質的優(yōu)化及乳腺泌乳生物學的研究提供了新的理論參考。
【關鍵詞】：奶牛乳腺上皮細胞 mi R-29s DNA甲基化 Dnmt3a Dnmt3b 泌乳
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 引言15-28
• 1.1 mi RNA的研究進展15-19
• 1.1.1 mi RNAs的提出及命名15
• 1.1.2 mi RNAs的形成及其作用機制的研究15-17
• 1.1.3 mi RNA 的檢測17-18
• 1.1.4 mi RNAs的鑒定及研究手段18
• 1.1.5 mi RNAs靶基因尋找及鑒定的研究18-19
• 1.2 泌乳生物學的研究現(xiàn)狀19-22
• 1.2.1 乳腺泌乳的過程20
• 1.2.2 乳腺泌乳的調(diào)節(jié)20-22
• 1.3 mi RNAs在乳腺發(fā)育及泌乳中的研究22-23
• 1.4 mi R-29家族的研究進展23-24
• 1.5 DNA甲基化及其在乳腺中的研究24-27
• 1.5.1 DNA甲基化的作用機制24-25
• 1.5.2 甲基轉移酶DNMT3A及DNMT3B的研究進展25-26
• 1.5.3 DNA甲基化在乳腺中的研究26-27
• 1.6 研究的目的和意義27-28
• 2 材料與方法28-51
• 2.1 實驗材料28
• 2.2 實驗主要試劑28-29
• 2.3 實驗儀器29-30
• 2.4 實驗方法30-50
• 2.4.1 mi R-29家族在不同乳品質奶牛乳腺組織中的表達30-31
• 2.4.2 mi R-29s靶基因的預測與分析31-32
• 2.4.3 DNMT3A和-3B在不同乳品質奶牛乳腺組織中的表達與定位32-35
• 2.4.4 細胞的培養(yǎng)與鑒定35-36
• 2.4.5 免疫熒光檢測DNMT3A、-3B在DCMECs中的定位表達36
• 2.4.6 mi R-29s靶基因Dnmt3a及Dnmt3b的鑒定36-41
• 2.4.7 mi R-29s基因超表達對奶牛乳腺上皮細胞的影響41-44
• 2.4.8 5-Aza-dc作用DCMECs后對泌乳相關基因m RNA表達的影響44-45
• 2.4.9 mi R-29s基因沉寂對奶牛乳腺上皮細胞的影響45-50
• 2.4.10 5-Aza-dc作用DCMECs后對mi R-29s表達的影響50
• 2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及分析50-51
• 3 結果51-100
• 3.1 mi R-29s在不同乳品質奶牛乳腺組織中的表達51-53
• 3.1.1 不同乳品質奶牛乳腺組織中RNA質量的檢測51-52
• 3.1.2 小RAN測序發(fā)現(xiàn)mi R-29s在不同乳品質乳腺組織中的差異表達52
• 3.1.3 q RT-PCR檢測mi R-29s在不同乳品質奶牛乳腺組織中的表達52-53
• 3.2 mi R-29s靶基因的預測53
• 3.3 DNMT3A /3B在不同乳品質奶牛乳腺組織中的表達及定位53-57
• 3.3.1 Dnmt3a/-3b在不同乳品質奶牛乳腺組織中m RNA的表達53-54
• 3.3.2 DNMT3A/3B在不同乳品質奶牛乳腺組織中蛋白的表達及定位54-57
• 3.4 細胞培養(yǎng)及奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能鑒定57-59
• 3.5 DNMT3A及-3B在奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)定位的觀察59-60
• 3.6 mi R-29s靶基因Dnmt3a及-3b的鑒定60-64
• 3.6.1 融合Dnmt3a、-3b 3′UTR的報告基因載體的構建60-61
• 3.6.2 融合Dnmt3a、-3b 3′UTR的EGFP載體的構建61-62
• 3.6.3 熒光素酶活性的檢測62-63
• 3.6.4 綠色熒光蛋白EGFP表達的檢測63-64
• 3.7 mi R-29s超表達對奶牛乳腺上皮細胞的影響64-74
• 3.7.1 q RT-PCR檢測mi R-29s mimics轉染DCMECs后mi R-29s的表達64-65
• 3.7.2 mi R-29s超表達對靶基因Dnmt3a及-3b m RNA表達的影響65-66
• 3.7.3 mi R-29s超表達對DNMT3A及-3B蛋白表達的影響66-67
• 3.7.4 mi R-29s超表達對DCMECs基因組GDM及甲基化酶活性的影響67-68
• 3.7.5 mi R-29s超表達對DCMECs泌乳相關信號通路基因表達的影響68
• 3.7.6 mi R-29s超表達對DCMECs泌乳相關信號通路蛋白表達的影響68-69
• 3.7.7 mi R-29s超表達對DCMECs活性及增殖能力的影響69-71
• 3.7.8 mi R-29s超表達對?-酪蛋白表達和分泌的影響71-73
• 3.7.9 mi R-29s超表達對細胞甘油三酯分泌的影響73
• 3.7.10 mi R-29s超表達對細胞乳糖分泌的影響73-74
• 3.8 mi R-29s基因沉寂對奶牛乳腺上皮細胞的影響74-97
• 3.8.1 q RT-PCR檢測mi R-29s抑制子轉染DCMECs后mi R-29s的表達74
• 3.8.2 mi R-29s沉寂對靶基因Dnmt3a及-3b m RNA表達的影響74-75
• 3.8.3 mi R-29s沉寂對DNMT3A及-3B蛋白表達的影響75-76
• 3.8.4 mi R-29s沉寂對DCMECs基因組GDM及甲基化酶活性的影響76-77
• 3.8.5 mi R-29s沉寂對DCMECs泌乳相關信號通路基因表達的影響77-78
• 3.8.6 mi R-29s沉寂對DCMECs泌乳相關信號通路蛋白表達的影響78-79
• 3.8.7 BSP分析mi R-29b沉寂后對泌乳相關基因啟動子甲基化的影響79-88
• 3.8.8 5-Aza-dc作用DCMECs后對泌乳相關基因m RAN表達的影響88-92
• 3.8.9 mi R-29s沉寂對DCMECs活性及增殖能力的影響92-93
• 3.8.10 mi R-29s沉寂對?-酪蛋白表達和分泌的影響93-95
• 3.8.11 mi R-29s沉寂對細胞甘油三酯分泌的影響95-96
• 3.8.12 mi R-29s沉寂對細胞乳糖分泌的影響96-97
• 3.9 DNA甲基化對DCMECs中mi R-29s表達的影響97-100
• 3.9.1 5-Aza-dc作用奶牛乳腺上皮細胞后對mi R-29s表達的影響97-98
• 3.9.2 5-Aza-dc作用DCMECs后對mi R-29b啟動子甲基化水平的影響98-100
• 4 討論100-109
• 4.1 mi R-29s在不同乳品質奶牛乳腺組織中的差異表達100-101
• 4.2 mi R-29s靶基因的預測及鑒定101-102
• 4.3 mi R-29s對DCMECs DNA甲基化的影響102-103
• 4.4 mi R-29s對DCMECs泌乳相關基因表達的影響及其作用機制103-106
• 4.5 mi R-29s對DCMECs增殖和活性的影響106
• 4.6 mi R-29s對DCMECs泌乳功能的影響106-107
• 4.7 5-Aza-dc對DCMECs中mi R-29s表達的影響107-108
• 4.8 mi R-29s調(diào)控DCMECs泌乳示意圖108-109
• 5 結論109-110
• 致謝110-111
• 參考文獻111-123
• 附錄123-124
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文124

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：miR-29家族對奶牛乳腺上皮細胞泌乳調(diào)控機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：281083