本文關鍵詞：稻瘟病菌Zn_2Cys_6和bHLH家族轉錄因子功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：稻瘟病是嚴重危害全球水稻產(chǎn)量的毀滅性真菌病害,其病原物稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)由于具有典型的生活史和侵染循環(huán),被認為是絲狀真菌致病機理和真菌分子生物學的適宜研究對象,同時也是研究病原真菌-寄主植物互作的模式生物之一。了解稻瘟病菌的致病過程和機理對于促進水稻稻瘟病的防治有重要作用。水稻和稻瘟病菌全基因組測序的完成為我們提供了大量的基因組信息,從這些浩如煙海的DNA信息中揭示基因的功能以及它們在時空上有序表達的機制,是后基因組時代研究的趨勢。轉錄因子是基因表達的調控因子,研究轉錄因子的生物學功能及其調控網(wǎng)絡,對于全面了解稻瘟病菌生長發(fā)育及其在致病過程中的分子機制具有重要意義。本文主要對Zn2Cys6和bHLH家族轉錄因子基因在稻瘟病菌生長發(fā)育和致病過程中的作用進行系統(tǒng)的分析。 Zn2Cys6家族是真菌中特有的一類轉錄因子,也是稻瘟病菌中基因數(shù)量最多的轉錄因子家族。在稻瘟病菌全基因組序列中共鑒定到163個Zn2Cys6家族基因,通過高通量基因敲除方法得到104個基因的缺失突變體,系統(tǒng)地分析了此104個突變體在稻瘟病菌菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生、附著胞形成、致病性和脅迫反應等方面的作用,其中25個基因影響產(chǎn)孢量,GCC1、MoCOD1和CONx1三個基因的突變體幾乎完全喪失產(chǎn)孢能力,菌絲塊接種水稻及大麥葉片顯示,△Mocod1完全喪失對寄主植物的侵染能力,而突變體△gcc1和△conx1仍然具有致病性；CNFl和CNF2是稻瘟病菌兩個產(chǎn)孢的負調控因子,突變體菌株對水稻的致病性嚴重下降；△ccal產(chǎn)生畸形的分生孢子,孢子懸浮液對水稻無致病能力,但菌絲塊接種離體水稻葉片仍能形成病斑,表明菌絲在寄主葉片形成的附著胞能夠穿透寄主角質層而形成侵染菌絲,繼而擴展表現(xiàn)為外部病斑。GCC1、GPF1和Gta1基因功能的缺失導致菌絲生長的缺陷,其中突變體△gpf1完全喪失對水稻的致病能力。 bHLH家族是真核生物中高度保守的一類轉錄因子,在稻瘟病菌全基因組序列中鑒定到9個bHLH家族基因(依次命名為MoHLH1-MoHLH9),本文對該九個基因進行了基因敲除和系統(tǒng)的功能分析,并著重探索MoHLH6對稻瘟病菌致病過程的調控作用。突變體△Mohlh6完全喪失了對完整和損傷宿主葉片的侵染能力；通過RFP-PTS1和GFP-PTS2共定位監(jiān)測過氧化物酶體的形態(tài)和數(shù)量,發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體在突變體孢子中數(shù)量較少；尼羅紅染色和MoCAP20定位實驗證實附著胞形成過程中脂滴由分生孢子向初生附著胞的轉運和附著胞成熟過程中脂滴的降解受阻；同時發(fā)現(xiàn)△Mohlh6附著胞的膨壓下降,而稻瘟病菌需要依賴足夠的附著胞膨壓才能穿透寄主表皮,因此突變體的穿透能力下降,致病能力基本喪失。通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)：Mohlh6與稻瘟病菌的激酶Osm1、CpkA和Mocmkk2和鈣調磷酸酶的調控亞基Mocnb1存在相互作用,因此該基因可能作為cAMP信號途徑、鈣調途徑和滲透調節(jié)途徑的下游轉錄因子參與調控稻瘟病菌的生長發(fā)育。同時通過RNA-seq和bHLH結構域的保守DNA結合位點分析,鑒定得到Mohlh6直接調控的下游基因,并通過敲除分析了其中十個基因的功能,進一步驗證了loHLH6基因在稻瘟病菌生長發(fā)育階段的調控作用。 綜上所述,本論文系統(tǒng)地研究了稻瘟病菌的Zn2Cys6和bHLH家族轉錄因子基因的功能,發(fā)現(xiàn)了很多對稻瘟病菌菌絲生長、分生孢子形成、附著胞發(fā)育和侵染致病等過程必不可少的基因,并詳細分析了突變體AMohlh6致病性喪失的原因、轉錄因子MoHLH6的上游調控激酶和下游代謝基因,較為全面地闡釋了MoHLH6基因的調控網(wǎng)絡。
【關鍵詞】：稻瘟病菌 Zn_2Cys_6家族轉錄因子 bHLH家族轉錄因子 生長發(fā)育 致病性
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第一章 文獻綜述14-35
• 1. 稻瘟病菌研究概況14-27
• 1.1 稻瘟病菌侵染循環(huán)15-17
• 1.2 稻瘟病菌產(chǎn)孢相關調控途徑17-18
• 1.3 稻瘟病菌附著胞代謝及相關調控途徑18-21
• 1.3.1 稻瘟病菌侵染相關發(fā)育過程的糖類代謝19-20
• 1.3.2 脂質的降解及甘油的積累20-21
• 1.4 稻瘟病菌的主要信號途徑21-27
• 1.4.1 G蛋白信號途徑22-23
• 1.4.2 cAMP-PKA信號途徑23-24
• 1.4.3 MAPK信號途徑24-26
• 1.4.4 鈣調信號途徑26-27
• 2. 稻瘟病菌轉錄因子研究概況27-33
• 2.1 鋅指結構轉錄因子28-30
• 2.2 堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結構轉錄因子30-31
• 2.3 同源異形盒(homoebox)結構轉錄因子31-32
• 2.4 bHLH結構轉錄因子32-33
• 3. 本研究的目的及內容33-35
• 第二章 材料與方法35-48
• 1 試驗菌株及培養(yǎng)條件35-37
• 1.1 稻瘟病菌菌株及培養(yǎng)條件35
• 1.2 細菌菌株及培養(yǎng)條件35
• 1.3 酵母菌株及培養(yǎng)條件35
• 1.4 培養(yǎng)基配方35-37
• 2 聚合酶鏈反應(PCR)37
• 2.1 常規(guī)PCR37
• 2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)37
• 3 質粒提取37-38
• 4 DNA操作38
• 5 遺傳轉化38-40
• 5.1 酵母轉化方法38-39
• 5.1.1 酵母感受態(tài)細胞的制備38-39
• 5.1.2 酵母轉化過程39
• 5.2 質粒大腸桿菌轉化39
• 5.3 稻瘟病菌轉化39-40
• 5.3.1 載體轉化農桿菌(凍融法)39-40
• 5.3.2 稻瘟病菌ATMT40
• 6 稻瘟病菌RNA及DNA的提取40-42
• 6.1 稻瘟病菌RNA提取步驟40-41
• 6.2 基因組DNA小量提取(用于轉化子的PCR驗證)41
• 6.3 CTAB法提取基因組DNA(用于qPCR驗證拷貝數(shù))41-42
• 7 稻瘟病菌基因組DNA Southern雜交42-43
• 7.1 大量提取稻瘟病菌基因組DNA42
• 7.2 Southern雜交探針DIG標記42
• 7.3 基因組DNA酶切、電泳及變性42-43
• 7.4 DNA轉膜、Southern雜交過程和免疫顯色43
• 8 稻瘟病菌Western雜交43
• 8.1 稻瘟病菌總蛋白的提取43
• 8.2 稻瘟病菌核蛋白的提取43
• 8.3 SDS-PAGE電泳及Western檢測43
• 9 酵母雙雜交43
• 10 突變體表型分析43-45
• 10.1 不同條件下的生長速度檢測44
• 10.2 產(chǎn)孢量測定44
• 10.3 分生孢子梗形態(tài)觀察44-45
• 10.4 分生孢子萌發(fā)及附著胞分析45
• 11 稻瘟病菌致病性分析45-46
• 11.1 大麥葉片離體接種45-46
• 11.2 水稻葉片離體接種46
• 11.3 水稻噴霧接種46
• 12 稻瘟病菌植物細胞侵染觀察46-47
• 12.1 大麥葉片侵染顯微觀察46
• 12.2 洋蔥表皮細胞穿透46-47
• 13 稻瘟病菌細胞結構觀察47-48
• 13.1 細胞核DAPI染色47
• 13.2 脂滴Nile Red染色47-48
• 第三章 稻瘟病菌Zn_2Cys_6轉錄因子的功能分析48-87
• 1 結果分析48-83
• 1.1 利用酵母同源重組原理進行高通量基因敲除48-49
• 1.2 稻瘟病菌Zn_2Cys_6轉錄因子的鑒定和敲除突變體的獲得49-51
• 1.3 系統(tǒng)分析Zn_2Cys_6轉錄因子對稻瘟病菌不同發(fā)育階段的影響51-63
• 1.4 影響稻瘟病菌菌絲生長和孢子產(chǎn)量的Zn_2Cys_6轉錄因子63-68
• 1.5 影響稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的Zn_2Cys_6轉錄因子68
• 1.6 對致病性必不可少的稻瘟病菌Zn_2Cys_6轉錄因子68-72
• 1.7 系統(tǒng)分析Zn_2Cys_6轉錄因子對脅迫壓力的反應72-78
• 1.8 RNA-seq分析突變體Δgpf1和Δcnf1表達差異基因78-83
• 2 本章討論83-87
• 第四章 稻瘟病菌bHLH轉錄因子的功能分析87-115
• 1 結果分析87-112
• 1.1 稻瘟病菌bHLH轉錄因子的鑒定和敲除突變體的獲得87
• 1.2 系統(tǒng)分析bHLH轉錄因子對稻瘟病菌不同發(fā)育階段的影響87-93
• 1.3 稻瘟病菌中MoHLH6基因的表達分析93-94
• 1.4 Mohlh6與Osm1、CpkA、Mocnb1和Mocmkk2存在互作現(xiàn)象94-96
• 1.5 RNA-seq分析突變體ΔMohlh6的差異表達基因96-97
• 1.6 Mohlh6結合位點分析97-100
• 1.7 Mohlh6靶標基因功能分析100-104
• 1.8 MoHLH6與稻瘟病菌過氧化物酶體的穩(wěn)定性相關104-106
• 1.9 MoHLH6的缺失影響脂滴的轉運和降解106-108
• 1.10 MoHLH6和Mohlh6靶標基因影響稻瘟病菌利用非發(fā)酵型碳源108-110
• 1.11 外源葡萄糖恢復MoHLH6和Mohlh6靶標基因缺失突變體致病性缺陷110-112
• 2 本章討論112-115
• 第五章 全文總結及展望115-117
• 1 結論115-116
• 2 后續(xù)研究工作116-117
• 參考文獻117-133
• 附錄133-150

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 ;A Gγ subunit promoter T-DNA insertion mutant——A1-412 of Magnaporthe grisea is defective in appressorium formation,penetration and pathogenicity[J];Chinese Science Bulletin;2006年18期

2 李海嬌;盧建平;劉小紅;張莉林;林福呈;;適用于稻瘟病菌基因敲除、過表達和熒光融合蛋白表達載體的構建和使用[J];農業(yè)生物技術學報;2012年01期

3 赫榮琳;樊榮輝;盧建平;林福呈;劉小紅;;稻瘟菌MoCMKK2基因的功能分析(英文)[J];細胞生物學雜志;2009年04期

4 張莉林;曹慧娟;厲曉東;林福呈;馮曉曉;盧建平;;稻瘟病菌翻譯調節(jié)腫瘤蛋白(MoTCTP)參與真菌生長和產(chǎn)孢的調控(英文)[J];中國細胞生物學學報;2013年08期

  本文關鍵詞：稻瘟病菌Zn_2Cys_6和bHLH家族轉錄因子功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：278298