本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌Zn_2Cys_6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：稻瘟病是嚴(yán)重危害全球水稻產(chǎn)量的毀滅性真菌病害,其病原物稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)由于具有典型的生活史和侵染循環(huán),被認(rèn)為是絲狀真菌致病機(jī)理和真菌分子生物學(xué)的適宜研究對(duì)象,同時(shí)也是研究病原真菌-寄主植物互作的模式生物之一。了解稻瘟病菌的致病過程和機(jī)理對(duì)于促進(jìn)水稻稻瘟病的防治有重要作用。水稻和稻瘟病菌全基因組測(cè)序的完成為我們提供了大量的基因組信息,從這些浩如煙海的DNA信息中揭示基因的功能以及它們?cè)跁r(shí)空上有序表達(dá)的機(jī)制,是后基因組時(shí)代研究的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)的調(diào)控因子,研究轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)于全面了解稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育及其在致病過程中的分子機(jī)制具有重要意義。本文主要對(duì)Zn2Cys6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)的分析。 Zn2Cys6家族是真菌中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,也是稻瘟病菌中基因數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族。在稻瘟病菌全基因組序列中共鑒定到163個(gè)Zn2Cys6家族基因,通過高通量基因敲除方法得到104個(gè)基因的缺失突變體,系統(tǒng)地分析了此104個(gè)突變體在稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)生、附著胞形成、致病性和脅迫反應(yīng)等方面的作用,其中25個(gè)基因影響產(chǎn)孢量,GCC1、MoCOD1和CONx1三個(gè)基因的突變體幾乎完全喪失產(chǎn)孢能力,菌絲塊接種水稻及大麥葉片顯示,△Mocod1完全喪失對(duì)寄主植物的侵染能力,而突變體△gcc1和△conx1仍然具有致病性；CNFl和CNF2是稻瘟病菌兩個(gè)產(chǎn)孢的負(fù)調(diào)控因子,突變體菌株對(duì)水稻的致病性嚴(yán)重下降；△ccal產(chǎn)生畸形的分生孢子,孢子懸浮液對(duì)水稻無致病能力,但菌絲塊接種離體水稻葉片仍能形成病斑,表明菌絲在寄主葉片形成的附著胞能夠穿透寄主角質(zhì)層而形成侵染菌絲,繼而擴(kuò)展表現(xiàn)為外部病斑。GCC1、GPF1和Gta1基因功能的缺失導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)的缺陷,其中突變體△gpf1完全喪失對(duì)水稻的致病能力。 bHLH家族是真核生物中高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子,在稻瘟病菌全基因組序列中鑒定到9個(gè)bHLH家族基因(依次命名為MoHLH1-MoHLH9),本文對(duì)該九個(gè)基因進(jìn)行了基因敲除和系統(tǒng)的功能分析,并著重探索MoHLH6對(duì)稻瘟病菌致病過程的調(diào)控作用。突變體△Mohlh6完全喪失了對(duì)完整和損傷宿主葉片的侵染能力；通過RFP-PTS1和GFP-PTS2共定位監(jiān)測(cè)過氧化物酶體的形態(tài)和數(shù)量,發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體在突變體孢子中數(shù)量較少；尼羅紅染色和MoCAP20定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)附著胞形成過程中脂滴由分生孢子向初生附著胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和附著胞成熟過程中脂滴的降解受阻；同時(shí)發(fā)現(xiàn)△Mohlh6附著胞的膨壓下降,而稻瘟病菌需要依賴足夠的附著胞膨壓才能穿透寄主表皮,因此突變體的穿透能力下降,致病能力基本喪失。通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Mohlh6與稻瘟病菌的激酶Osm1、CpkA和Mocmkk2和鈣調(diào)磷酸酶的調(diào)控亞基Mocnb1存在相互作用,因此該基因可能作為cAMP信號(hào)途徑、鈣調(diào)途徑和滲透調(diào)節(jié)途徑的下游轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控稻瘟病菌的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)通過RNA-seq和bHLH結(jié)構(gòu)域的保守DNA結(jié)合位點(diǎn)分析,鑒定得到Mohlh6直接調(diào)控的下游基因,并通過敲除分析了其中十個(gè)基因的功能,進(jìn)一步驗(yàn)證了loHLH6基因在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育階段的調(diào)控作用。 綜上所述,本論文系統(tǒng)地研究了稻瘟病菌的Zn2Cys6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子基因的功能,發(fā)現(xiàn)了很多對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子形成、附著胞發(fā)育和侵染致病等過程必不可少的基因,并詳細(xì)分析了突變體AMohlh6致病性喪失的原因、轉(zhuǎn)錄因子MoHLH6的上游調(diào)控激酶和下游代謝基因,較為全面地闡釋了MoHLH6基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
【關(guān)鍵詞】：稻瘟病菌 Zn_2Cys_6家族轉(zhuǎn)錄因子 bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子 生長(zhǎng)發(fā)育 致病性
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.111.41
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-35
• 1. 稻瘟病菌研究概況14-27
• 1.1 稻瘟病菌侵染循環(huán)15-17
• 1.2 稻瘟病菌產(chǎn)孢相關(guān)調(diào)控途徑17-18
• 1.3 稻瘟病菌附著胞代謝及相關(guān)調(diào)控途徑18-21
• 1.3.1 稻瘟病菌侵染相關(guān)發(fā)育過程的糖類代謝19-20
• 1.3.2 脂質(zhì)的降解及甘油的積累20-21
• 1.4 稻瘟病菌的主要信號(hào)途徑21-27
• 1.4.1 G蛋白信號(hào)途徑22-23
• 1.4.2 cAMP-PKA信號(hào)途徑23-24
• 1.4.3 MAPK信號(hào)途徑24-26
• 1.4.4 鈣調(diào)信號(hào)途徑26-27
• 2. 稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子研究概況27-33
• 2.1 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子28-30
• 2.2 堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子30-31
• 2.3 同源異形盒(homoebox)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子31-32
• 2.4 bHLH結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子32-33
• 3. 本研究的目的及內(nèi)容33-35
• 第二章 材料與方法35-48
• 1 試驗(yàn)菌株及培養(yǎng)條件35-37
• 1.1 稻瘟病菌菌株及培養(yǎng)條件35
• 1.2 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)條件35
• 1.3 酵母菌株及培養(yǎng)條件35
• 1.4 培養(yǎng)基配方35-37
• 2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)37
• 2.1 常規(guī)PCR37
• 2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)37
• 3 質(zhì)粒提取37-38
• 4 DNA操作38
• 5 遺傳轉(zhuǎn)化38-40
• 5.1 酵母轉(zhuǎn)化方法38-39
• 5.1.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備38-39
• 5.1.2 酵母轉(zhuǎn)化過程39
• 5.2 質(zhì)粒大腸桿菌轉(zhuǎn)化39
• 5.3 稻瘟病菌轉(zhuǎn)化39-40
• 5.3.1 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(凍融法)39-40
• 5.3.2 稻瘟病菌ATMT40
• 6 稻瘟病菌RNA及DNA的提取40-42
• 6.1 稻瘟病菌RNA提取步驟40-41
• 6.2 基因組DNA小量提取(用于轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證)41
• 6.3 CTAB法提取基因組DNA(用于qPCR驗(yàn)證拷貝數(shù))41-42
• 7 稻瘟病菌基因組DNA Southern雜交42-43
• 7.1 大量提取稻瘟病菌基因組DNA42
• 7.2 Southern雜交探針DIG標(biāo)記42
• 7.3 基因組DNA酶切、電泳及變性42-43
• 7.4 DNA轉(zhuǎn)膜、Southern雜交過程和免疫顯色43
• 8 稻瘟病菌Western雜交43
• 8.1 稻瘟病菌總蛋白的提取43
• 8.2 稻瘟病菌核蛋白的提取43
• 8.3 SDS-PAGE電泳及Western檢測(cè)43
• 9 酵母雙雜交43
• 10 突變體表型分析43-45
• 10.1 不同條件下的生長(zhǎng)速度檢測(cè)44
• 10.2 產(chǎn)孢量測(cè)定44
• 10.3 分生孢子梗形態(tài)觀察44-45
• 10.4 分生孢子萌發(fā)及附著胞分析45
• 11 稻瘟病菌致病性分析45-46
• 11.1 大麥葉片離體接種45-46
• 11.2 水稻葉片離體接種46
• 11.3 水稻噴霧接種46
• 12 稻瘟病菌植物細(xì)胞侵染觀察46-47
• 12.1 大麥葉片侵染顯微觀察46
• 12.2 洋蔥表皮細(xì)胞穿透46-47
• 13 稻瘟病菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察47-48
• 13.1 細(xì)胞核DAPI染色47
• 13.2 脂滴Nile Red染色47-48
• 第三章 稻瘟病菌Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子的功能分析48-87
• 1 結(jié)果分析48-83
• 1.1 利用酵母同源重組原理進(jìn)行高通量基因敲除48-49
• 1.2 稻瘟病菌Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和敲除突變體的獲得49-51
• 1.3 系統(tǒng)分析Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子對(duì)稻瘟病菌不同發(fā)育階段的影響51-63
• 1.4 影響稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)量的Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子63-68
• 1.5 影響稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子68
• 1.6 對(duì)致病性必不可少的稻瘟病菌Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子68-72
• 1.7 系統(tǒng)分析Zn_2Cys_6轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脅迫壓力的反應(yīng)72-78
• 1.8 RNA-seq分析突變體Δgpf1和Δcnf1表達(dá)差異基因78-83
• 2 本章討論83-87
• 第四章 稻瘟病菌bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能分析87-115
• 1 結(jié)果分析87-112
• 1.1 稻瘟病菌bHLH轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和敲除突變體的獲得87
• 1.2 系統(tǒng)分析bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)稻瘟病菌不同發(fā)育階段的影響87-93
• 1.3 稻瘟病菌中MoHLH6基因的表達(dá)分析93-94
• 1.4 Mohlh6與Osm1、CpkA、Mocnb1和Mocmkk2存在互作現(xiàn)象94-96
• 1.5 RNA-seq分析突變體ΔMohlh6的差異表達(dá)基因96-97
• 1.6 Mohlh6結(jié)合位點(diǎn)分析97-100
• 1.7 Mohlh6靶標(biāo)基因功能分析100-104
• 1.8 MoHLH6與稻瘟病菌過氧化物酶體的穩(wěn)定性相關(guān)104-106
• 1.9 MoHLH6的缺失影響脂滴的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解106-108
• 1.10 MoHLH6和Mohlh6靶標(biāo)基因影響稻瘟病菌利用非發(fā)酵型碳源108-110
• 1.11 外源葡萄糖恢復(fù)MoHLH6和Mohlh6靶標(biāo)基因缺失突變體致病性缺陷110-112
• 2 本章討論112-115
• 第五章 全文總結(jié)及展望115-117
• 1 結(jié)論115-116
• 2 后續(xù)研究工作116-117
• 參考文獻(xiàn)117-133
• 附錄133-150

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 ;A Gγ subunit promoter T-DNA insertion mutant——A1-412 of Magnaporthe grisea is defective in appressorium formation,penetration and pathogenicity[J];Chinese Science Bulletin;2006年18期

2 李海嬌;盧建平;劉小紅;張莉林;林福呈;;適用于稻瘟病菌基因敲除、過表達(dá)和熒光融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和使用[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2012年01期

3 赫榮琳;樊榮輝;盧建平;林福呈;劉小紅;;稻瘟菌MoCMKK2基因的功能分析(英文)[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2009年04期

4 張莉林;曹慧娟;厲曉東;林福呈;馮曉曉;盧建平;;稻瘟病菌翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白(MoTCTP)參與真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的調(diào)控(英文)[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2013年08期

  本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌Zn_2Cys_6和bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：278298