【摘要】：解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens, BAF)作為一種潛在益生菌,具備芽孢桿菌類菌種的抗逆性強、代謝產(chǎn)物多等特點,且已被廣泛用于生物防治領(lǐng)域。此前對解淀粉芽孢桿菌的研究大多集中在抑制植物病原菌和真菌的作用機理。隨著對解淀粉芽孢桿菌研究的深入,不斷有報道稱其在抑制動物病原菌和促進畜禽生長發(fā)育等方面同樣效果顯著。另一方面,試驗技術(shù)的不斷進步,尤其各類組學(xué)的發(fā)展使研究者可以更加全面、系統(tǒng)地探究疾病、環(huán)境變化、營養(yǎng)水平等因素對動物機體帶來的影響。本研究分別圍繞解淀粉芽孢桿菌的抗逆性、抑菌機理以及對肉雞盲腸內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)和代謝物的影響進行了初步研究,旨在為解淀粉芽孢桿菌作為一種益生菌應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。試驗一：解淀粉芽孢桿菌的抗逆性、粘附性和抑菌圖譜本試驗利用高溫、模擬胃液、人工腸液等處理方式檢測解淀粉芽孢桿菌的抗逆性,通過革蘭氏染色的方法觀察菌株粘附Caco-2細(xì)胞的能力,并利用牛津杯試驗繪制BAF的抑菌圖譜。試驗結(jié)果顯示,解淀粉芽孢桿菌有較好的耐高溫和耐受人工胃液和腸液的能力：1)85℃處理后,活菌數(shù)超過57.4%；2)pH 2.0胃蛋白酶處理1 h后仍有36%活菌數(shù)；3)良好地耐受0.1%濃度的膽鹽；4)胰蛋白酶處理3 h后活菌數(shù)沒有發(fā)生顯著性變化。采用革蘭氏染色和常規(guī)計數(shù)的試驗方法發(fā)現(xiàn),BAF與Caco-2細(xì)胞共同孵育后,菌種定植數(shù)量隨孵育時間的延長而迅速增加,2 h后可達到7.02±0.83 cell-1,說明菌種具有良好的細(xì)胞粘附性。利用菌落分析儀觀察抑菌圈直觀地顯示了解淀粉芽孢桿菌具有較好的抑制動物病原菌能力,結(jié)果表明BAF發(fā)酵上清可以廣譜抑制沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和普通變形桿菌等病原菌,尤以48 h的發(fā)酵上清的抑制效果最好；另外,對腸道主要有益菌(嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌等)無抑菌效果。試驗二：解淀粉芽孢桿菌的抑菌機理試驗利用酸沉淀法得到解淀粉芽孢桿菌上清液中的脂肽類粗提物,并用牛津杯試驗進一步驗證其良好的抑菌作用。掃描電鏡和透射電鏡觀察脂肽類粗提物的殺菌機制發(fā)現(xiàn),其對病原菌的細(xì)胞膜具有一定的破壞作用；試驗用來做比較的抗生素金霉素和硫酸新霉素同樣具有破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特點。之后利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測了24-72 h BAF發(fā)酵上清中的脂肽類粗提物,發(fā)現(xiàn)其中主要的抑菌成分為伊枯草霉素A和表面活性素。解淀粉芽孢桿菌抑制病原菌粘附細(xì)胞的試驗顯示,其主要通過菌體的競爭性和排斥性抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌對細(xì)胞的定植,菌體驅(qū)逐性試驗和菌體上清液FST競爭性抑菌效果不顯著。鼠傷寒沙門氏菌侵染Caco-2細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示,BAF菌體及FST均不能降低細(xì)胞的凋亡率；同時對細(xì)胞做透射電鏡的結(jié)果顯示鼠傷寒沙門氏菌侵染后,細(xì)胞膜出現(xiàn)褶皺且胞內(nèi)有空泡出現(xiàn),但BAF及FST同樣不能改善細(xì)胞形態(tài)；共聚焦顯微圖片也驗證了流式細(xì)胞儀的結(jié)論,沙門氏菌侵染的細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光強度較對照細(xì)胞增強,BAF和FST的添加并不能改善遭受侵染的Caco-2細(xì)胞的胞內(nèi)活性氧熒光的強度。上述試驗說明解淀粉芽孢桿菌不能抑制鼠傷寒沙門氏菌對細(xì)胞的侵染。試驗三：飼喂解淀粉芽孢桿菌對肉雞生長性能、小腸發(fā)育、血液生化免疫指標(biāo)、盲腸揮發(fā)性脂肪酸及菌群的影響試驗選取1日齡健康肉雞(Ross 308) 540羽,隨機分為3個處理組(空白對照組、抗生素組、解淀粉芽孢桿菌組),每組6個重復(fù),每重復(fù)30羽。試驗肉雞在第1、7、14、21、28、35和42日齡時宰殺,取樣并檢測各項指標(biāo)。數(shù)據(jù)顯示：相對于空白對照組,日糧中添加解淀粉芽孢桿菌增加了14-42日齡肉雞的體重(P0.05),顯著提高了8-14和1-42日齡肉雞的平均日增重；增加了28日齡肉雞回腸的體重校正長度(P0.05),顯著增加14和28日齡肉雞小腸的相對腸重。與對照組和抗生素組相比,解淀粉芽孢桿菌組42日齡肉雞血清中總蛋白的含量顯著增加,7和21日齡肉雞血清中IgG和IgM的含量顯著性提高。與空白對照組相比,解淀粉芽孢桿菌組肉雞盲腸微生物菌群的多樣性發(fā)生了顯著性變化。另外,7日齡解淀粉芽孢桿菌組肉雞盲腸內(nèi)容物中丁酸和21日齡丙酸的濃度均顯著高于對照和抗生素組肉雞；解淀粉芽孢桿菌組組42日齡肉雞盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸和丁酸的濃度顯著高于對照組肉雞。試驗四：利用高通量測序研究解淀粉芽孢桿菌對肉雞盲腸內(nèi)菌群多樣性的影響本試驗結(jié)合高通量測序技術(shù),對肉雞盲腸內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性進行了研究。試驗選取1日齡Ross 308肉雞360羽,隨機分為3個處理組(對照組、抗生素組、解淀粉芽孢桿菌組),每組6個重復(fù),每重復(fù)20羽。試驗肉雞在第1、7、21和42日齡時宰殺,取盲腸內(nèi)容物檢測(每6只肉雞盲腸內(nèi)容物合為一管)。檢測結(jié)束后,對測序質(zhì)量進行評估,并分別就單樣本OTU及多樣本菌群多樣性進行比較。試驗結(jié)果顯示：1)抗生素組肉雞在7日齡時OTU數(shù)量顯著低于解淀粉芽孢桿菌和對照組,但后兩者間差異不顯著；OTU等級顯示微生物菌群序列深度基本覆蓋樣品中的所有物種,滿足試驗分析需要；2)不同時間不同試驗組肉雞盲腸均含有特異OTU；3)多樣品間OTUs熱圖分析顯示不同組肉雞樣本各自聚集在一起；4)OTU等級曲線顯示21日齡肉雞盲腸微生物OTU曲線坡度已趨于平緩,說明菌群分布均勻；5)群落結(jié)構(gòu)圖表明盲腸微生物在門水平上主要包含厚壁菌、變形菌、擬桿菌門和無壁菌門；屬水平主要由Faecalibacterium、乳桿菌、糞芽孢菌、瘤胃球菌、厭氧原體、擬桿菌和變形桿菌等構(gòu)成；6)物種多樣性分析綜合考慮了豐度指數(shù)、多樣性指數(shù)和覆蓋率指數(shù)等,數(shù)據(jù)顯示解淀粉芽孢桿菌的添加不會對肉雞盲腸菌群的多樣性和相對豐度產(chǎn)生顯著性改變,但抗生素的顯著減少了早期肉雞盲腸微生物的相對豐度及多樣性；7)與7日齡對照組相比,解淀粉芽孢桿菌組肉雞盲腸中優(yōu)勢菌顫螺菌(10.2%)、毛螺旋菌(10.9%)比例顯著提高,抗生素組變形菌門、Blautia屬(梭菌目)(3.8%)和乳桿菌(1.2%)顯著增加；21日齡解淀粉芽孢桿菌組優(yōu)勢菌Faecalibacterium(16.4%),瘤胃球菌(12.6%),抗生素組肉雞盲腸中優(yōu)勢菌Dorea(3.0%)顯著性增加；42日齡解淀粉芽孢桿菌組盲腸內(nèi)優(yōu)勢菌Faecalibacterium(22.4%)和擬桿菌(3.4%)的比例顯著增加,抗生素組肉雞盲腸中優(yōu)勢菌僅瘤胃球菌(7.1%)顯著性地減少,其他菌群無差異性變化。試驗五：代謝組學(xué)分析抗生素和解淀粉芽孢桿菌對生長初期肉雞血漿和盲腸代謝產(chǎn)物的影響本試驗利用代謝組學(xué)研究了采食添加抗生素和解淀粉芽孢桿菌日糧后,生長早期肉雞血漿和盲腸中代謝產(chǎn)物的變化。1日齡Ross 308肉雞360羽,隨機分為3個處理組(空白對照組、抗生素組、解淀粉芽孢桿菌組),每組6個重復(fù),每重復(fù)20羽。試驗肉雞在第1、7、14和21日齡時宰殺,并收集1、7、14和21日齡肉雞盲腸樣本和1日齡、21日齡肉雞血漿樣本。試驗數(shù)據(jù)顯示：1)PCA得分圖上,各組在不同時間點均可較好地各自聚類,說明日糧中添加抗生素和解淀粉芽孢桿菌對肉雞血清和盲腸中代謝產(chǎn)物產(chǎn)生一定影響。2)經(jīng)過PLS建模和OPLS-DA篩選出主要差異性代謝產(chǎn)物,其中21日齡肉雞血漿中,抗生素組20種差異代謝物發(fā)生顯著性變化,纈氨酸、羥基脯氨酸、半乳糖酸、尿酸、草酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、棕櫚油酸甲酯、單棕櫚酸甘油酯等含量升高,主要涉及氨基酸代謝；解淀粉芽孢桿菌組共13種代謝物發(fā)生顯著性變化,其中二羥基苯甲酸、α-D-磷酸葡萄糖胺、天冬氨酸、纈氨酸和蛋氨酸含量升高,主要涉及氨基酸代謝和脂肪酸代謝。3)21日齡肉雞盲腸中,抗生素組9種差異性代謝物發(fā)生顯著性變化,其中麥芽三糖與單棕櫚酸三油酯含量升高,主要涉及碳水化合物消化與吸收和脂肪酸代謝；解淀粉芽孢桿菌11種差異代謝物發(fā)生顯著性變化,其中龍膽二糖、奎尼酸、3,7,12-糞甾烷酸、甘氨酸、N-乙酰-D-半乳糖胺和丁胺酸等含量顯著升高,主要涉及氨基酸代謝和甘油酯代謝。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S831.5

【參考文獻】

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1 林顯華;孫合美;谷巍;;枯草芽孢桿菌B7對肉雞生長性能及免疫性能的影響[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年02期

2 許麗惠;祁瑞雪;王長康;王全溪;謝麗曲;林麗花;陳慶達;;發(fā)酵豆粕對黃羽肉雞生長性能、血清生化指標(biāo)、腸道黏膜免疫功能及微生物菌群的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年04期

3 張娟;楊彩梅;曹廣添;曾新福;劉金松;;解淀粉芽孢桿菌及其作為益生菌的應(yīng)用[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2014年04期

4 滑靜,郭玉琴,張淑萍,孫英健,門瑞霄;肉仔雞日糧中添加枯草芽孢桿菌對平均日增質(zhì)量和血液生化指標(biāo)的影響[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2003年02期

5 于卓騰;毛勝勇;朱偉云;;微生態(tài)制劑和飼用抗生素對肉雞盲腸VFA和微生物區(qū)系的影響[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2007年03期

6 湯江武;孫宏;姚曉紅;吳逸飛;王新;;芽孢桿菌在肉雞腸道內(nèi)的分布及對腸道菌群、消化酶活性的影響[J];浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2011年03期

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本文編號：2770031