【摘要】：丹參Salvia miltiorrhiza Bunge,屬唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬(Salvia Linn),是重要的藥用植物。丹參使用歷史悠久,最早記錄見于距今兩千多年的《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,用于治療心腦血管等諸多疾病。丹參主要有效成分為:水溶性的丹酚酸類和脂溶性的丹參酮類,其中丹參酮屬于二萜醌類。為了弄清丹參酮生物合成途徑,本研究以丹參基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),經(jīng)過基因克隆、基因結(jié)構(gòu)分析和表達(dá)模式分析以及遺傳轉(zhuǎn)化等手段,對(duì)丹參次生代謝相關(guān)基因類貝殼杉烯合酶基因Sm KSL3和轉(zhuǎn)錄因子Sm SPL進(jìn)行了研究,并利用T-DNA插入激活標(biāo)簽載體構(gòu)建丹參突變體庫(kù)以期尋找到更多與次生代謝相關(guān)的基因�；诜治龊蛯�(shí)驗(yàn)取得了如下的結(jié)果:1、丹參Sm KSL3基因克隆與表達(dá)調(diào)控分析在丹參基因組數(shù)據(jù)中,經(jīng)過與Sm KSL1及擬南芥等模式植物的KSL基因進(jìn)行同源比對(duì),推測(cè)基因組中的一個(gè)長(zhǎng)285bp的contig為丹參KSL基因片段,據(jù)此設(shè)計(jì)引物、運(yùn)用RACE及RT-PCR技術(shù)首次克隆得到編碼區(qū)全長(zhǎng)1245bp的另一個(gè)與丹參酮合成相關(guān)的重要基因:Sm KSL3�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明:Sm KSL3含有5′端的非翻譯區(qū)(5′UTR)208bp,在3′端有明顯的poly A結(jié)構(gòu),顯示出完整的基因結(jié)構(gòu),其編碼區(qū)長(zhǎng)1245bp,蛋白質(zhì)分子式為C2123H3321N565O638S24,含有414個(gè)氨基酸,屬疏水性不穩(wěn)定蛋白。經(jīng)保守域(conserve domain)、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)等生信分析,推測(cè)Sm KSL3屬于I類丹參合酶,參與催化GPP、FPP或GGPP環(huán)化形成單萜、倍半萜或二萜尤其是萜烯的合成。將序列相似度較高的9種植物KSL基因與Sm KSL1和Sm KSL3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,顯示丹參Sm KSL1和Sm KSL3基因與其他物種相似的基因在遺傳上都有一定距離。這些物種都不作為藥用植物,據(jù)此可推知丹參作為藥用植物,其有效成分、次生代謝物的生物合成可能有不同的下游途徑。構(gòu)建了Sm KSL1-GFP和Sm KSL3-GFP融合表達(dá)載體,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草,經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察其瞬時(shí)表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Sm KSL3-GFP定位于細(xì)胞質(zhì),而Sm KSL1-GFP定位于葉綠體�；虮磉_(dá)模式分析顯示Sm KSL1和Sm KSL3均在根中高表達(dá),對(duì)外施茉莉酸甲酯(JA)有響應(yīng):Sm KSL1在36h時(shí)表達(dá)顯著升高,Sm KSL3則在24h時(shí)顯著升高。據(jù)此推測(cè)Sm KSL1和Sm KSL3均可能參與丹參次生代謝過程,并且在時(shí)間和空間上是相對(duì)獨(dú)立的:Sm KSL1定位于質(zhì)體,主要參與質(zhì)體途徑合成萜類,而Sm KSL3缺少N-端的細(xì)胞器定位信號(hào),主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。Sm KSL1和Sm KSL3在不同的時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)外界刺激,對(duì)生物體具有重要的生理作用。為后續(xù)深入研究Sm KSL1和Sm KSL3的功能,構(gòu)建了原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中成功表達(dá)出蛋白質(zhì)并純化,蛋白純度均90%。將Sm KSL3與含兩個(gè)Ca MV35S強(qiáng)啟動(dòng)子的PBI121載體連接構(gòu)建了Sm KSL3過表達(dá)載體。另外利用人工小RNA技術(shù)構(gòu)建了Sm KSL3-artificial mi RNA敲減載體。兩種載體均用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行丹參的遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)初步鑒定獲得過表達(dá)Sm KSL3的轉(zhuǎn)基因丹參植株3株和Sm KSL3 knock-down的轉(zhuǎn)基因丹參植株6株。為進(jìn)一步深入研究Sm KSL3的功能、揭示Sm KSL1和Sm KSL3的功能分工奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2、丹參SmSPL轉(zhuǎn)錄因子的克隆與調(diào)控及功能分析SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-likes)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。通過對(duì)丹參基因組序列的分析、比對(duì),預(yù)測(cè)出15個(gè)Sm SPL基因,隨后利用RACE和RT-PCR法對(duì)它們進(jìn)行了分子克隆。序列測(cè)定和分析結(jié)果表明,丹參Sm SPL具有多樣化的序列特征和基因結(jié)構(gòu)。丹參Sm SPL基因均含有SBP結(jié)構(gòu)域,大多與兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(CX4CX16CX2H和CX4CX16CX2C)相重合。比較分析表明丹參Sm SPL和對(duì)應(yīng)的擬南芥At SPL之間具有序列的保守性。將丹參Sm SPL和擬南芥At SPL進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)丹參Sm SPL可分為6個(gè)組。同一組或同一亞組內(nèi)的SPL往往含有相同的motif,暗示這些SPL的功能可能是相近或冗余的。如:At SPL8與花青素和赤霉素的生物合成等有關(guān),二者與次生代謝密切相關(guān),而Sm SPL12與At SPL8同屬一組,暗示Sm SPL12也有可能參與丹參花青素形成等次生代謝過程。另外經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)8個(gè)丹參SPL是mi R156/157的靶基因。用改良的5′-RACE方法驗(yàn)證了mi R156/157的靶基因和切割位點(diǎn)。丹參SPL基因在不同組織中差異表達(dá)。受mi R156/157調(diào)控的那些丹參SPL(Sm SPL2,Sm SPL3,Sm SPL5,Sm SLP6,Sm SPL8,Sm SPL11,Sm SPL14,Sm SPL15)的表達(dá)量隨著丹參植株的成熟而升高,然而在此過程中,mi R156/157的表達(dá)量下降。這一方面證實(shí)了mi R156/157對(duì)Sm SPL基因的調(diào)控作用,另一方面也表明Sm SPL在丹參發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外,丹參植株成熟過程中,mi R156/157的表達(dá)與mi R172的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。mi R156、mi R172和SPL主要調(diào)控植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過渡的時(shí)間。這種生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)變對(duì)于植物次生代謝物的積累有重大的影響。我們獲得的這些結(jié)果暗示了Sm SPL、mi R156和mi R172介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在丹參發(fā)育階段調(diào)控中的重要性和復(fù)雜性。3、T-DNA插入激活標(biāo)簽突變體庫(kù)的構(gòu)建為了發(fā)現(xiàn)更多參與丹參次生代謝途徑的基因,構(gòu)建了兼有激活標(biāo)簽和基因捕獲功能的T-DNA插入載體PBI-intron-GUS-4Enhancer,用此載體轉(zhuǎn)化丹參建立丹參突變體庫(kù)。在此過程中,除了用已報(bào)道的遺傳轉(zhuǎn)化方法,我們用鏈霉素(streptomycin)作篩選,摸索出在了在本實(shí)驗(yàn)體系中較易重復(fù)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得插入突變陽(yáng)性植株,其中1株具有明顯表型。為發(fā)現(xiàn)和研究丹參次生代謝相關(guān)新基因奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S567.53


本文編號(hào)：2748187