本文關(guān)鍵詞：梨WoxT1 mRNA韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：果樹嫁接無性繁殖時(shí),砧木會(huì)對接穗的樹形、抗性、果實(shí)品質(zhì)等產(chǎn)生影響。這種影響除了與生理結(jié)構(gòu)、激素和營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)外,還與mRNA等大分子物質(zhì)遠(yuǎn)距離傳遞有關(guān)。目前有關(guān)mRNA韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞機(jī)理在草本植物上取得了一定的進(jìn)展,但是對于多年生木本植物的果樹來說,研究進(jìn)展緩慢。本研究以杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)為試驗(yàn)材料,通過環(huán)剝、嫁接等園藝措施結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)手段克隆鑒定獲得一個(gè)具有韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞功能的WUSCHEL-RELATEDHOMEOBOX mRNA,并且能夠?qū)χ仓晷螒B(tài)產(chǎn)生影響；體外互作、共轉(zhuǎn)基因后嫁接實(shí)驗(yàn)等證明該基因mRNA與多聚嘧啶結(jié)合(PTB)蛋白結(jié)合在韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞。其主要研究結(jié)果如下： 1、結(jié)合基因組,從杜梨中克隆獲得12個(gè)WOX基因C1-C12; NCBI-blast和SMART結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)C1-C12均具有典型的Homedomain結(jié)構(gòu)域,其中C6具有4個(gè)未知的LCR區(qū),與其他成員結(jié)構(gòu)不同。RT-PCR分析顯示,C6在根、莖尖、葉片和韌皮部中輕微表達(dá)；聚類分析發(fā)現(xiàn)C6與擬南芥WUS基因聚在一起,但C6結(jié)構(gòu)與AtWUS結(jié)構(gòu)略有不同,加之,后續(xù)研究證明C6具有遠(yuǎn)距離傳遞能力,故將C6命名為PbWoxT1. 2, PbWoxT1基因全長1286bp,分子量約為36KD；1年生杜梨莖原位雜交結(jié)果顯示,PbWoxT1在韌皮部篩管伴胞中表達(dá)較強(qiáng)；PbWoxT1-GFP載體基因槍轟擊洋蔥表皮及PEG轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示PbWoxT1主要定位在細(xì)胞核中,并在細(xì)胞膜上呈不規(guī)則點(diǎn)狀聚集。超表達(dá)PbWoxT1能夠使煙草形態(tài)發(fā)生變化：葉片上表皮絨毛增多,個(gè)別葉片變?yōu)樯鬃訝�；莖部發(fā)生扭曲,呈不規(guī)則形；主根消失,側(cè)根生長旺盛。但這些癥狀會(huì)隨著植株生長逐漸消失。 3、對杜梨?zhèn)戎M(jìn)行兩道環(huán)剝后利用RT-PCR對韌皮部中PbWoxT1檢測發(fā)現(xiàn),PbWoxT1信號會(huì)由于韌皮部集流的阻斷而消失,初步推測韌皮部中的PbWoxT1可能由其他部位運(yùn)輸而來；在對3年生杜梨實(shí)生苗進(jìn)行不同環(huán)剝處理發(fā)現(xiàn),PbWoxT1主要在側(cè)枝、主干頂部以及根部合成后隨著韌皮部集流進(jìn)行遠(yuǎn)距離運(yùn)輸,在韌皮部中不合成PbWoxT1;利用CAPs分析‘鴨梨’微嫁接杜梨體系以及2年生的‘鴨梨’/杜梨植株進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn),在‘鴨梨’/杜梨內(nèi),PbWoxT1能夠通過韌皮部進(jìn)行雙向傳遞。 4、為了進(jìn)一步確定PbWoxT1具有遠(yuǎn)距離傳遞性,選用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)PbWoxT1全長融合GFP進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因,野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草不同組合嫁接30d后對野生型接穗或砧木進(jìn)行RT-PCR檢測確定PbWoxT1具有雙向傳遞的能力；并且轉(zhuǎn)基因植株為砧木能夠使得野生型接穗花柱變長。 5、根據(jù)PbWoxT1結(jié)構(gòu)域?qū)⑵鋭h減成不同片段來確定PbWoxT1主要傳遞區(qū)域,在伴胞特異啟動(dòng)子CoYMv驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因,以野生型植株為接穗轉(zhuǎn)基因植株為砧木進(jìn)行嫁接, RT-PCR檢測接穗中PbWoxT1片段的傳遞信號,統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：包含PbWoxT1234-781區(qū)域的片段均具有傳遞性,PbWoxT1174-384(低于50%)、PbWoxT1680-1286不傳遞。MEME分析刪減片段發(fā)現(xiàn),CTCT多聚嘧啶結(jié)構(gòu)區(qū)為傳遞片段特有區(qū)域。 6、多聚嘧啶結(jié)合(PTB)蛋白能夠與RNA上CUCU結(jié)構(gòu)區(qū)特定結(jié)合。根據(jù)基因組分析在杜梨中克隆得到3個(gè)PTB蛋白,聚類分析發(fā)現(xiàn)PbPTB3與CmRBP50同源性較近,且具有4個(gè)RRM區(qū)且定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,與PbPTBl和PbPTB2有所不同。]tNA-Protein Pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PbPTB3蛋白能夠與可遠(yuǎn)距離傳遞的PbGAI, PbWoxT1都能結(jié)合,而PbPTB1蛋白和PbPTB2只能與其中一個(gè)傳遞RNA結(jié)合。因此,我們對PbPTB3在mRNA韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞中的作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。 7、免疫定位分析發(fā)現(xiàn)PbPTB3在杜梨莖部伴胞中表達(dá)強(qiáng)烈。利用伴胞特異啟動(dòng)子SUC2驅(qū)動(dòng)PbPTB3融合1nCherry進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)基因,與野生型接穗嫁接30d后,Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)在野生型接穗中能檢測到融合蛋白。說明伴胞中產(chǎn)生的PbPTB3蛋白通過嫁接口進(jìn)行了傳遞；選育PbWoxT1和PbPTB3單轉(zhuǎn)和雙轉(zhuǎn)基因煙草植株,進(jìn)行不同組合嫁接,鑒定發(fā)現(xiàn)：PbPTB3能夠促進(jìn)PbWoxT1在嫁接體系中傳遞量和傳遞率的增加,說明PbPTB3在PbWoxT1mRNA韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞過程中起重要作用。 綜上所述,我們認(rèn)為PbWoxT1作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的可通過韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞mRNA,能夠在伴胞中與PbPTB3以及其他一些非細(xì)胞自治蛋白形成一個(gè)RNP復(fù)合體,這個(gè)復(fù)合體在韌皮部集流的推動(dòng)下通過嫁接口進(jìn)行遠(yuǎn)距離移動(dòng),進(jìn)而對樹形發(fā)育、樹勢平衡進(jìn)行調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：杜梨 PbWoxT1 PbPTB3 嫁接 mRNA傳遞 RNP復(fù)合體 韌皮部
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S661.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略詞表10-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 嫁接在園藝作物栽培育種中的應(yīng)用12
• 1.2 果樹砧穗間相互影響及作用12-14
• 1.2.1 果樹砧木對接穗生理生化特性的影響12-13
• 1.2.2 果樹接穗對砧木生理生化特性的影響13
• 1.2.3 果樹接穗與砧木之間相互作用的機(jī)制13-14
• 1.3 砧穗間相互作用的分子機(jī)理14-19
• 1.3.1 植物體韌皮部運(yùn)輸系統(tǒng)14
• 1.3.2 植物體韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞的RNA的種類14-16
• 1.3.3 韌皮部mRNA遠(yuǎn)距離傳遞機(jī)制16-18
• 1.3.4 mRNA遠(yuǎn)距離運(yùn)輸對園藝作物砧穗間相互作用影響及機(jī)理18-19
• 1.4 WOX基因的研究進(jìn)展19-20
• 1.5 研究目的及意義20-22
• 第二章 梨WOX家族基因克隆及分析22-37
• 引言22
• 2.1 材料與方法22-30
• 2.1.1 試驗(yàn)材料22
• 2.1.2 試劑22-23
• 2.1.3 培養(yǎng)基和溶液的配制23
• 2.1.4 試驗(yàn)方法23-30
• 2.2 結(jié)果與分析30-35
• 2.2.1 梨WOX家族基因的克隆30
• 2.2.2 梨WOX基因內(nèi)含子分析30-31
• 2.2.3 梨WOX基因組織特異性分析31-32
• 2.2.4 梨WOX基因結(jié)構(gòu)域分析32-33
• 2.2.5 梨WOX基因進(jìn)化樹分析33-35
• 2.3 討論35-37
• 2.3.1 關(guān)于WOX家族基因的命名35
• 2.3.2 杜梨WOX家族不同進(jìn)化枝成員分析35-37
• 第三章 梨PbWoxT1基因定位分析及功能研究37-55
• 引言37
• 3.1 材料與方法37-48
• 3.1.1 試驗(yàn)材料37
• 3.1.2 試劑37
• 3.1.3 試劑配制37-40
• 3.1.4 試驗(yàn)方法40-48
• 3.2 結(jié)果與分析48-53
• 3.2.0 PbWoxT1序列分析48-49
• 3.2.1 PbWoxT1基因組織特異性分析49
• 3.2.2 PbWoxT1 mRNA在杜梨莖原位雜交分析49-50
• 3.2.3 PbWoxT1亞細(xì)胞定位50-51
• 3.2.4 PbWoxT1玉米原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位51-52
• 3.2.5 PbWoxT1不同區(qū)域細(xì)胞定位52-53
• 3.2.6 PbWoxT1煙草轉(zhuǎn)基因功能鑒定53
• 3.3 討論53-55
• 第四章 杜梨WoxT1基因mRNA分子韌皮部遠(yuǎn)傳遞性分析55-75
• 引言55
• 4.1 材料與方法55-61
• 4.1.1 試驗(yàn)材料55
• 4.1.2 試劑55
• 4.1.3 培養(yǎng)基55-56
• 4.1.4 試驗(yàn)方法56-61
• 4.2 結(jié)果61-72
• 4.2.1 環(huán)剝驗(yàn)證PbWoxT1通過杜梨韌皮部進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳遞61-62
• 4.2.2 PbWoxT1在鴨梨嫁接杜梨體系中傳遞性鑒定62-65
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草嫁接驗(yàn)證PbWoxT1傳遞性65-69
• 4.2.4 PbWoxT1傳遞區(qū)域篩選69-72
• 4.3 討論72-75
• 第五章 PTB3在PbWoxT1 mRNA遠(yuǎn)距離傳遞過程中的作用75-91
• 引言75
• 5.1 材料與方法75-82
• 5.1.1 試驗(yàn)材料75
• 5.1.2 試劑75-76
• 5.1.3 試劑配制76-77
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)方法77-82
• 5.2 結(jié)果82-89
• 5.2.1 梨PTB家族基因克隆與分析82-83
• 5.2.2 梨PTB家族蛋白原生質(zhì)體定位83
• 5.2.3 梨PTB家族蛋白與PbWoxT1 mRNA互作驗(yàn)證83-85
• 5.2.4 PbPTB3蛋白在杜梨莖中免疫定位分析85
• 5.2.5 PbPTB3蛋白在煙草嫁接體系中的傳遞驗(yàn)證85-87
• 5.2.6 PbPTB3在PbWoxT1遠(yuǎn)距離傳遞中的作用87-89
• 5.3 討論89-91
• 結(jié)論91-92
• 參考文獻(xiàn)92-103
• 致謝103-104
• 個(gè)人簡歷104

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 牛自勉,梁德聲,房耀仁;蘋果砧木脫落酸與樹木生長規(guī)律的研究[J];北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1991年03期

2 張建光,劉玉芳,施瑞德;不同砧木上蘋果品種光合特性比較研究[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年05期

3 牛自勉,李全,郜曉夢,張忠仁;SDC系蘋果矮化砧木生長、結(jié)果及抗逆性的研究[J];果樹科學(xué);1994年03期

4 周瑞金;杜國強(qiáng);師校欣;馬寶q;;影響轉(zhuǎn)基因蘋果試管微嫁接苗成活的因子[J];果樹學(xué)報(bào);2007年02期

5 陳杰忠,鄒俊渝;不同砧木甜橙幼樹生長量及葉片礦質(zhì)元素含量的研究[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1993年04期

6 周開兵,夏仁學(xué),馬鋼旗;2種基砧的錦橙樹高接華紅臍橙的栽培表現(xiàn)和某些生理生化指標(biāo)的差異[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

7 王淑杰,王家民,王連君,李亞東;葡萄接穗對砧木生理特性的影響[J];中外葡萄與葡萄酒;2001年04期

8 賀紅霞,麻鵬達(dá),楊美英,王興智;植物中RNA分子系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2005年03期

  本文關(guān)鍵詞：梨WoxT1 mRNA韌皮部遠(yuǎn)距離傳遞機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：271848