本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用基因隨機突變提高雞柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2蛋白質(zhì)免疫原性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞球蟲病是一類由專性細胞內(nèi)寄生的艾美耳球蟲引起的腸道原蟲疾病。據(jù)估計每年全世界用于預(yù)防和治療球蟲病成本會超過30億美元,中國每年約有30多億人民幣。目前球蟲病的防控主要依靠藥物與疫苗,隨著耐藥蟲株的出現(xiàn)和針對抗球蟲藥物的立法限制,人們更加重視免疫預(yù)防。市場上的疫苗主要為多種雞艾美耳球蟲活卵囊的混合,具有很好的免疫保護效果,但是由于活疫苗存在安全問題以及較高的生產(chǎn)成本,研究者們將更多的精力用于以亞單位為基礎(chǔ)的新型分子疫苗的研制。新型分子疫苗研制依靠具有較好抗原性以及免疫原性的抗原,由于球蟲復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)以及生活史,抗原鑒定的難度以及抗原免疫原性篩選的限制阻礙了亞單位疫苗研制的進展。研究者們也開展了大量的研究來改善抗原的免疫保護效果,包括新佐劑的研制,益生菌誘導(dǎo)的非特異性免疫等,但是這些都不能從根本上改善抗原的免疫原性。因此,改善已有疫苗可能是一個快速和有效的方法。定向進化被廣泛用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域,其中重要的應(yīng)用之一就是改善抗原的免疫原性。關(guān)鍵氨基酸的改變對于抗原的免疫反應(yīng)和免疫識別有很大影響,比如可逆抑制宿主的免疫反應(yīng)、影響T細胞的激活、改善蛋白質(zhì)免疫原性等,使用隨機突變構(gòu)建基因突變庫是定向進化常用的方法之一。EtMIC家族蛋白質(zhì)在球蟲移行、入侵宿主細胞以及胞內(nèi)生存方面有重要的作用,EtMIC2蛋白質(zhì)能夠在柔嫩艾美耳球蟲的整個生活周期內(nèi)都表達,研究表明EtMIC2基因或者蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)部分免疫保護反應(yīng),是很好的疫苗候選抗原。使用隨機突變技術(shù)針對EtMIC2進行定向進化,建立基因突變庫,使用酵母表面展示技術(shù)結(jié)合FACS以及動物免疫保護試驗篩選目的變異蛋白質(zhì),從而改善EtMIC2蛋白質(zhì)的免疫原性,為球蟲疫苗的研制提供基礎(chǔ)。1.EtMIC2基因變異庫的構(gòu)建以未突變的EtMIC2基因為模板,使用epPCR進行擴增,獲得約33μg的epPCR產(chǎn)物,與T1克隆載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌細胞內(nèi)。經(jīng)323個氨芐抗性的瓊脂平板篩選,獲得107個E. coli單克隆。挑取每個平板上的20個單菌落進行PCR鑒定,6460個菌落中有5782個顯示為陽性,陽性率達到89.5%。為分析epPCR的突變頻率以及突變在基因中的分布,隨機選擇了陽性克隆中的21變異EtMIC2基因進行序列鑒定,經(jīng)比對分析在951bp的變異基因中平均出現(xiàn)了6.86+3.21個突變位點,編碼的蛋白質(zhì)有4.19±2.68個氨基酸突變,而且突變位點在EtMIC2基因中隨機分布,與我們之前的試驗設(shè)計一致,結(jié)果證明EtMIC2基因突變庫構(gòu)建成功。2. EtMIC2蛋白質(zhì)變異庫的構(gòu)建PCR擴增基因突變庫中的EtMIC2片段,與pCTCON2質(zhì)粒進行雙酶切后連接并轉(zhuǎn)染釀酒酵母EBY100,涂布SD-CAA篩選平板,獲得大約為108個酵母克隆。經(jīng)誘導(dǎo)表面展示后,以兔源抗EtMIC2蛋白質(zhì)多抗作為一抗,FITC標記的鼠抗兔IgG單抗作為二抗標記展示的變異蛋白質(zhì),使用免疫熒光檢測蛋白的表達情況。利用100mM DTT還原Agalp和Aga2p之間的二硫鍵,游離表面展示的變異蛋白,使用兔源抗EtMIC2蛋白質(zhì)多抗進行Western blot鑒定,結(jié)果顯示EtMIC2變異蛋白質(zhì)庫成功展示于酵母細胞表面。3.EtMIC2蛋白質(zhì)變異庫的篩選使用流式細胞分選儀對酵母表面展示的蛋白質(zhì)突變庫進行篩選,基于抗原抗體反應(yīng)親和力的強弱為篩選條件設(shè)三個篩選門(P1,P2和P3),經(jīng)過三次連續(xù)的篩選從108個進樣酵母菌中收集到401個具有不同熒光信號強度的細胞。將篩選的酵母菌涂布固體篩選SD-CAA平板,培養(yǎng)后獲得19個酵母克隆菌落。為獲得變異EtMIC2的基因序列,提取酵母菌中的重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR擴增與T1載體連接后測序。經(jīng)分析19個突變株中有5株蛋白質(zhì)的氨基酸序列未發(fā)生突變,6株蛋白質(zhì)出現(xiàn)終止密碼子,剩余7株變異EtMIC2蛋白質(zhì)分別有2,3,4,6,8,11和14個突變氨基酸。同時使用免疫熒光以及流式細胞儀檢測19株變異蛋白質(zhì)的熒光信號,并分析了與氨基酸突變的關(guān)系。4.變異EtMIC2蛋白質(zhì)抗球蟲感染的保護效果評價將EtMIC2以及7種變異基因克隆至pET30a表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)誘導(dǎo)表達以及純化后獲得高純度的蛋白質(zhì),并使用鼠源抗His標簽單抗進行Western blot進行鑒定。將變異蛋白質(zhì)與弗氏佐劑乳化后制作亞單位疫苗,在雛雞7和14日齡時進行頸部皮下多點注射免疫兩次,二免后七天除不免疫不感染球蟲組(PBS-Ⅰ)外皆接種30,000個柔嫩艾美耳球蟲卵囊。結(jié)果顯示相對于不免疫感染球蟲組(PBS-Ⅱ),各蛋白免疫組的體重增長升高顯著,卵囊排出以及病變積分均有顯著性的降低(P0.05)。與未突變的蛋白質(zhì)免疫組相比,1130,2119以及2118組中盲腸病變記分以及1130組糞便的卵囊排出均顯著降低,ACI結(jié)果顯示1130和2119組變異蛋白質(zhì)能夠提供良好的保護力,而且2119以及1130免疫組的淋巴細胞針對EtMIC2和EtMIC2變異蛋白質(zhì)的刺激后的增殖效果,感染球蟲后第10天外周血淋巴細胞中CD4+和CD8+的比例,以及感染球蟲第0,10天盲腸黏膜中的sIgA的抗體水平都顯著增高(P0.05)。試驗結(jié)果表明變異后的EtMIC2蛋白質(zhì)抗球蟲的免疫保護效果得到顯著改善,篩選到兩株變異蛋白質(zhì)(2119和1130)能夠改善抗原的免疫原性以及免疫保護作用。表明通過隨機突變改善球蟲抗原的免疫原性以及免疫保護力是可行的,這是首次使用隨機突變來改變寄生蟲蛋白質(zhì)的免疫原性。
【關(guān)鍵詞】：Eimeria tenella EtmIC2 隨機突變 酵母表面展示 FACS 免疫原性與免疫保護力
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 符號說明6-12
• 中文摘要12-15
• ABSTRACT15-19
• 1 前言19-42
• 1.1 雞球蟲病及免疫防治研究進展19-29
• 1.1.1 雞球蟲病病原概述19
• 1.1.2 雞球蟲生活史19-20
• 1.1.3 雞球蟲病危害20-21
• 1.1.4 雞球蟲病藥物防治現(xiàn)狀21-23
• 1.1.5 雞球蟲免疫研究進展23-25
• 1.1.6 雞球蟲疫苗研究進展25-28
• 1.1.7 艾美耳球蟲微線蛋白研究進展28-29
• 1.2 表面展示系統(tǒng)概述及其應(yīng)用29-33
• 1.2.1 酵母表面展示29-31
• 1.2.2 細胞表面展示31
• 1.2.3 噬菌體表面展示31-32
• 1.2.4 無細胞展示技術(shù)32-33
• 1.3 定向進化研究進展33-38
• 1.3.1 定向進化概述33-34
• 1.3.2 基因突變庫的構(gòu)建方法34-36
• 1.3.3 突變文庫的高通量篩選策略36-38
• 1.4 定向進化在免疫學(xué)方面的應(yīng)用38-40
• 1.4.1 通過定向進化抗體親和力成熟38-39
• 1.4.2 定向進化改善抗原的免疫原性以及免疫保護力39-40
• 1.4.3 通過定向進化鑒定靶向配體40
• 1.5 本研究的目的意義40-42
• 2 材料與方法42-65
• 2.1 試驗材料42-43
• 2.1.1 試驗菌株、寄生蟲株與載體42-43
• 2.1.2 試驗動物43
• 2.1.3 主要試劑與藥品43
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備43
• 2.1.5 試劑的配制43
• 2.2 試驗方法43-65
• 2.2.1 試驗設(shè)計43-45
• 2.2.2 引物設(shè)計45
• 2.2.3 球蟲RNA的提取45-46
• 2.2.4 EtMIC2基因的PCR擴增46
• 2.2.5 EtMIC2氨基酸序列同源比對分析46
• 2.2.6 EtMIC2基因的克隆46-47
• 2.2.7 易錯PCR擴增EtMIC2基因47-48
• 2.2.8 EtMIC2基因突變庫的克隆48-49
• 2.2.9 突變EtMIC2基因庫的鑒定49
• 2.2.10 EtMIC2基因庫的建立49
• 2.2.11 酵母表面展示重組質(zhì)粒的構(gòu)建49-51
• 2.2.12 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染釀酒酵母EBY10051-52
• 2.2.13 變異蛋白質(zhì)庫誘導(dǎo)表達52
• 2.2.14 免疫熒光檢測變異蛋白質(zhì)展示52
• 2.2.15 SDS-PAGE和Western blot檢測EtMIC2的展示表達52-55
• 2.2.16 FACS篩選目的變異蛋白質(zhì)55
• 2.2.17 篩選后變異株鑒定55-57
• 2.2.18 變異蛋白質(zhì)的原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建57-58
• 2.2.19 原核蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達及純化58-60
• 2.2.20 亞單位疫苗制備60
• 2.2.21 球蟲卵囊活化60-61
• 2.2.22 雞球蟲感染試驗設(shè)計61-63
• 2.2.23 血清和黏膜抗體的檢測63-64
• 2.2.24 雞淋巴細胞增殖試驗64
• 2.2.25 淋巴細胞亞群檢測64-65
• 3 試驗結(jié)果65-89
• 3.1 基因突變庫的構(gòu)建65-71
• 3.1.1 EtMIC2氨基酸序列分析65
• 3.1.2 T1-EtMIC2重組質(zhì)粒的構(gòu)建65-66
• 3.1.3 EtMIC2基因突變庫的構(gòu)建66-67
• 3.1.4 突變的EtMIC2基因的序列測定及分析67-71
• 3.2 蛋白質(zhì)突變庫的構(gòu)建71-72
• 3.2.1 變異EtMIC2蛋白質(zhì)庫的酵母展示重組質(zhì)粒構(gòu)建71
• 3.2.2 EtMIC2蛋白質(zhì)突變庫表面展示71-72
• 3.2.3 展示EtMIC2蛋白質(zhì)Western blot鑒定72
• 3.3 FACS篩選目的突變體72-77
• 3.3.1 流式細胞儀篩選展示變異蛋白質(zhì)的EBY100酵母菌菌株72-73
• 3.3.2 篩選的EtMIC2變異蛋白質(zhì)的序列測定73-75
• 3.3.3 七株突變EtMIC2蛋白質(zhì)的表面展示效果分析75-76
• 3.3.4 EtMIC2變異蛋白質(zhì)氨基酸突變類型分析76-77
• 3.4 變異蛋白質(zhì)的原核表達77-80
• 3.4.1 變異蛋白質(zhì)的原核表達及純化77-79
• 3.4.2 變異蛋白質(zhì)Western blot檢測79
• 3.4.3 變異蛋白質(zhì)濃度測定79-80
• 3.5 變異蛋白質(zhì)免疫保護效果評價80-89
• 3.5.1 體重增長80-81
• 3.5.2 卵囊排出81-82
• 3.5.3 盲腸病變積分82-83
• 3.5.4 抗球蟲指數(shù)(ACI)83
• 3.5.5 外周血T淋巴細胞增值試驗83-84
• 3.5.6 CD4~+和CD8~+T淋巴細胞亞群的檢測結(jié)果84-86
• 3.5.7 血清IgG抗體檢測86-87
• 3.5.8 盲腸黏膜sIgA抗體水平檢測結(jié)果87-89
• 4 討論89-97
• 5 結(jié)論97-98
• 參考文獻98-113
• 附錄113-116
• 致謝116-117
• 攻讀學(xué)位期間論文發(fā)表情況117

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用基因隨機突變提高雞柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2蛋白質(zhì)免疫原性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：271131