【摘要】：14-3-3γ通過mTOR途徑調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞乳合成乳品質(zhì)是乳品工業(yè)的重要基礎(chǔ),而乳蛋白含量是乳品質(zhì)的代表性指標。近年來,隨著乳品工業(yè)的發(fā)展和健康消費的需求,人們對乳制品的需求越來越多。但在中國和很多發(fā)展中國家,生乳品質(zhì)低下已成為制約奶牛飼養(yǎng)行業(yè)的關(guān)鍵因素。研究人員開始聚焦如何提高乳品質(zhì)和產(chǎn)量,而通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法闡明乳蛋白和乳脂肪合成的調(diào)控機理已成為這一領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容。國內(nèi)外研究已取得了一定的進展,已證實PI3K/AKT/mTOR是調(diào)控細胞生長和增殖的主要信號通路,而在奶牛乳腺上皮細胞營養(yǎng)素和激素能夠通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)乳的合成。14-3-3蛋白家族成員廣泛存在于各類生物組織細胞中,參與很多生物學(xué)過程,如細胞生長、細胞周期、增殖、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等。14-3-3蛋白通過決定底物的亞細胞定位以促進和抑制有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)如mTOR信號通路過程。盡管已有很多這方面的報道,但還不清楚14-3-3是否通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)乳合成和細胞增殖。本實驗室前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作發(fā)現(xiàn),14-3-3γ與乳蛋白合成相關(guān),但其作用機制尚不清楚。因此本文通過基因功能研究以闡明14-3-3γ是否通過調(diào)節(jié)乳合成和細胞增殖。首先采用組織塊法培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細胞,采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞角蛋白18和β-酪蛋白的表達以確定細胞純化成功并具有泌乳的能力。激光共聚焦顯微鏡觀察表明14-3-3γ定位于細胞漿和細胞核。Western blotting分析表明,蛋氨酸、賴氨酸、雌激素和催乳素均能刺激14-3-3γ表達,HPLC檢測發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白的分泌也顯著增加,甘油三酯試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)乳脂肪的分泌也顯著增加,CASY細胞活力分析儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞活力和細胞數(shù)也顯著增加。這些結(jié)果提示14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細胞泌乳和增殖過程中起著正向調(diào)節(jié)作用。構(gòu)建pGCMV-IRES-EGFP-14-3-3γ表達載體,并轉(zhuǎn)入原代奶牛乳腺上皮細胞,繼而利用G418篩選構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染14-3-3γ的原代奶牛乳腺上皮細胞系,以此為材料研究14-3-3γ對奶牛乳腺上皮細胞泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ過表達后,mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達顯著上調(diào),細胞活力和細胞數(shù)顯著增加,細胞分泌酪蛋白和甘油三酯顯著增多。另一方面,將14-3-3γ的siRNA利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入原代奶牛乳腺上皮細胞,觀察其對泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ基因沉寂后,mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達顯著下調(diào),細胞活力和細胞數(shù)顯著下降,細胞分泌酪蛋白和甘油三酯顯著減少。以上結(jié)果表明14-3-3γ應(yīng)答氨基酸、激素等外源信號,通過激活mTOR信號通路正向調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞乳合成和細胞增殖。本文同時對14-3-3γ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進行了生物信息學(xué)分析,討論其發(fā)揮作用的分子機制。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823

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本文編號：2660827