【摘要】：14-3-3γ通過mTOR途徑調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成乳品質(zhì)是乳品工業(yè)的重要基礎(chǔ),而乳蛋白含量是乳品質(zhì)的代表性指標(biāo)。近年來,隨著乳品工業(yè)的發(fā)展和健康消費(fèi)的需求,人們對(duì)乳制品的需求越來越多。但在中國和很多發(fā)展中國家,生乳品質(zhì)低下已成為制約奶牛飼養(yǎng)行業(yè)的關(guān)鍵因素。研究人員開始聚焦如何提高乳品質(zhì)和產(chǎn)量,而通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法闡明乳蛋白和乳脂肪合成的調(diào)控機(jī)理已成為這一領(lǐng)域的主要研究內(nèi)容。國內(nèi)外研究已取得了一定的進(jìn)展,已證實(shí)PI3K/AKT/mTOR是調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的主要信號(hào)通路,而在奶牛乳腺上皮細(xì)胞營養(yǎng)素和激素能夠通過mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳的合成。14-3-3蛋白家族成員廣泛存在于各類生物組織細(xì)胞中,參與很多生物學(xué)過程,如細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、增殖、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等。14-3-3蛋白通過決定底物的亞細(xì)胞定位以促進(jìn)和抑制有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)如mTOR信號(hào)通路過程。盡管已有很多這方面的報(bào)道,但還不清楚14-3-3是否通過mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳合成和細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作發(fā)現(xiàn),14-3-3γ與乳蛋白合成相關(guān),但其作用機(jī)制尚不清楚。因此本文通過基因功能研究以闡明14-3-3γ是否通過調(diào)節(jié)乳合成和細(xì)胞增殖。首先采用組織塊法培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞,采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞角蛋白18和β-酪蛋白的表達(dá)以確定細(xì)胞純化成功并具有泌乳的能力。激光共聚焦顯微鏡觀察表明14-3-3γ定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。Western blotting分析表明,蛋氨酸、賴氨酸、雌激素和催乳素均能刺激14-3-3γ表達(dá),HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白的分泌也顯著增加,甘油三酯試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳脂肪的分泌也顯著增加,CASY細(xì)胞活力分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)也顯著增加。這些結(jié)果提示14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和增殖過程中起著正向調(diào)節(jié)作用。構(gòu)建pGCMV-IRES-EGFP-14-3-3γ表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞,繼而利用G418篩選構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染14-3-3γ的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞系,以此為材料研究14-3-3γ對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ過表達(dá)后,mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達(dá)顯著上調(diào),細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)顯著增加,細(xì)胞分泌酪蛋白和甘油三酯顯著增多。另一方面,將14-3-3γ的siRNA利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞,觀察其對(duì)泌乳和增殖的影響。發(fā)現(xiàn)14-3-3γ基因沉寂后,mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白表達(dá)顯著下調(diào),細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)顯著下降,細(xì)胞分泌酪蛋白和甘油三酯顯著減少。以上結(jié)果表明14-3-3γ應(yīng)答氨基酸、激素等外源信號(hào),通過激活mTOR信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳合成和細(xì)胞增殖。本文同時(shí)對(duì)14-3-3γ的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,討論其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：2660827