【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS)是由PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)傳染病,主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和產(chǎn)木乃伊胎,仔豬表現(xiàn)為呼吸障礙。PRRS已成為全球養(yǎng)豬業(yè)中最嚴(yán)重的疾病之一,我國于1996年首次發(fā)現(xiàn)此病,PRRS給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失。目前,防治PRRS的常用方法是接種疫苗,市場上常用的PRRS疫苗主要有減毒活疫苗(Modified live vaccine,MLV)和滅活疫苗(Inactivated vaccine,IV),減毒活疫苗保護(hù)性好,但因RNA病毒變異頻繁導(dǎo)致疫苗具有很強(qiáng)的毒株特異性,且存在病毒基因重組和毒力返強(qiáng)的危險。滅活疫苗安全性好,但不能誘導(dǎo)足夠的細(xì)胞免疫,也不能提供足夠的保護(hù)力,亟需有效的疫苗佐劑增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞,其表面表達(dá)許多模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRR),DCs能夠識別捕獲并加工處理抗原,將其遞呈給體內(nèi)初始型T細(xì)胞,引起T細(xì)胞的分化,從而將先天性免疫和獲得性免疫聯(lián)系起來。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是表達(dá)于DCs表面的一類重要的PRR,可特異性識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),啟動下游的信號傳導(dǎo)通路,引起炎性細(xì)胞因子、I型干擾素、趨化因子和抗菌肽的分泌,激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞直接殺傷病原體,在先天性免疫防御和獲得性免疫防御中起重要作用。蛋白質(zhì)組學(xué)對于研究生命活動規(guī)律,闡明疾病機(jī)理及找尋疾病的早期分子標(biāo)志有重要意義。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用日益廣泛,其研究方法也不斷更新。2004年,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出了新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)同位素相對標(biāo)記和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)。該技術(shù)具有定量敏感、反應(yīng)迅速、標(biāo)記完全、重復(fù)性高、高通量、定性定量同時進(jìn)行的特點,已在微生物、動植物、神經(jīng)組織等領(lǐng)域有所應(yīng)用。1、TLR3、7配體與PRRSV滅活抗原不同組合感染Mo DCs的試驗本試驗將TLR3配體poly(I:C)及TLR7配體imiquimod與PRRSV滅活抗原不同組合孵育Mo DCs。我們首先運用real time PCR的方法,對各組細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子和th2型細(xì)胞因子mrna的表達(dá)量進(jìn)行了測定,然后elisa檢測各組細(xì)胞上清中th1型細(xì)胞因子與th2型細(xì)胞因子的蛋白分泌量。結(jié)果顯示,poly(i:c)-imiquimod-prrsv滅活抗原孵育組中,th1型細(xì)胞因子與th2型細(xì)胞因子mrna及蛋白的表達(dá)量顯著高于其他各組(p0.05)。為了闡明tlr3、7配體增強(qiáng)modcs對prrsv滅活抗原的免疫應(yīng)答機(jī)制,我們檢測各組細(xì)胞不同時間點tlr信號通路節(jié)點分子的trif、myd88及nf-κbp65mrna水平及各組細(xì)胞不同時間點中細(xì)胞質(zhì)蛋白trif、myd88及磷酸化-iκbα和細(xì)胞核蛋白中nf-κbp65的蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示,與prrsv滅活抗原孵育組相比,poly(i:c)-imiquimod-prrsv滅活抗原孵育組中trif、myd88及nf-κbp65的mrna水平在8h都顯著升高,細(xì)胞質(zhì)蛋白中trif、myd88及磷酸化-iκbα的蛋白表達(dá)量在8h和12h均有明顯升高,細(xì)胞核蛋白中nf-κbp65的蛋白水平呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,其他各組均未能引起通路下游nf-κbp65和磷酸化-iκbα表達(dá)量的變化。同時,nf-κb抑制劑bay11-7082預(yù)處理poly(i:c)-imiquimod-prrsv滅活抗原孵育組細(xì)胞后,其細(xì)胞因子mrna的表達(dá)量回落到本底水平,由此實驗可知,協(xié)同使用poly(i:c)、imiquimod及prrsv滅活抗原激活了modcs中trif/myd88-nf-κb信號通路并由此引起了細(xì)胞因子的分泌,其中nf-κb對細(xì)胞因子的分泌起到了關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。另外,流式細(xì)胞儀對各處理組modcs吞噬prrsv的能力進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,tlr3、7配體能夠增強(qiáng)modcs的吞噬能力,且poly(i:c)、imiquimod合用的增強(qiáng)效果最顯著(p0.05)。2、tlr3、7配體與prrsv滅活抗原不同組合免疫小鼠的試驗小鼠免疫試驗中,我們將tlr3、7配體與prrsv滅活抗原不同組合后免疫小鼠,結(jié)果顯示,poly(i:c)-imiquimod-prrsv滅活抗原免疫組小鼠中淋巴細(xì)胞增殖及脾淋巴細(xì)胞中cd4+、cd8+t細(xì)胞的百分含量顯著高于其他各組(p0.05)。poly(i:c)與imiquimod合用作為佐劑免疫后的小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞既能夠顯著促進(jìn)th1型t細(xì)胞的增殖又可顯著促進(jìn)th2型t細(xì)胞的增殖(p0.05)。poly(i:c)-imiquimod-prrsv滅活抗原免疫組小鼠血清中th1型細(xì)胞因子和th2型細(xì)胞因子的濃度及血清中和抗體滴度顯著高于其他各組(p0.05)。3、高致病性prrsvsd-jn感染modcs蛋白質(zhì)組學(xué)分析試驗itraq試驗共檢測到252個表達(dá)變化差異顯著的蛋白(p≤0.05且ratios≥1.5-fold或ratios≤0.67)。對此差異蛋白進(jìn)行了go分析、kegg通路分析和cog分析。結(jié)果顯示,所有差異顯著變化蛋白中與PRRSV受體相關(guān)的波形蛋白(vimentin)和清道夫受體(CD163)的表達(dá)量顯著變化。與內(nèi)吞(endocytosis)clathrin依賴途徑中的clathrin相關(guān)蛋白如clathrin重鏈蛋白(clathrin heavy chain,CLTC),clathrin輕鏈蛋白(clathrin light chain,CLTA),磷脂酰肌醇結(jié)合網(wǎng)格蛋白(phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein,PICALM)和apetela 2蛋白(AP2)的表達(dá)量顯著升高。與抗原遞呈有關(guān)的MHC II類分子SLA-DR的表達(dá)量顯著升高。與JAK-STAT信號通路相關(guān)蛋白及其下游因子中的STAT1、Mx1、Mx2和OAS2的表達(dá)量顯著升高。與actin細(xì)胞骨架有關(guān)的支架蛋白(Ras GTPase-activating-like protein,IQGAP)包括IQGAP1和IQGAP2的表達(dá)量顯著下降。我們用western blot的方法對PICALM、STAT1和Mx1蛋白的變化進(jìn)行了驗證,驗證結(jié)果與i TRAQ分析結(jié)果一致。為了更好地了解PRRSV與MoDCs的相互作用,我們用STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)軟件對變化差異顯著蛋白的相互關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),變化差異顯著的蛋白主要集中在核糖體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和生物代謝途徑中。綜上所述,聯(lián)合使用TLR3、7配體可通過TLR/My D88-NF-κB信號通路增強(qiáng)Mo DCs的抗原遞呈功能,并增強(qiáng)了小鼠對PRRSV滅活抗原的免疫反應(yīng)。TLR3、7配體的組合可作為PRRS滅活疫苗的新型候選免疫佐劑。蛋白質(zhì)組學(xué)的iTRAQ分析結(jié)果為進(jìn)一步了解PRRSV感染Mo DCs的免疫機(jī)制和致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

表 1-1 PRRSV 非結(jié)構(gòu)蛋白功能Table 1-1 The function of PRRSV non-structural proteins（Fang and Snijder, 2010）圖 1-1 （A）PRRSV 的基因組結(jié)構(gòu)（B）mRNA 亞基因組結(jié)構(gòu)中的 3’嵌套結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 (A) Genome organization of PRRSV (B) 3’nested set of subgenomic mRNAs（Meulenberg, 2000）

和 TLR4 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用（圖 1-2）。研究發(fā)現(xiàn)，缺失 TRAF3 可引起 TRIF 介導(dǎo)的 I 型干擾素分泌量減少，但當(dāng)缺失 TRAF6 時則不影響 I 型干擾素的分泌量。TLR3 和 TLR4 經(jīng)過 TRIF 募集 TRAF3，TRAF3 與 TBK1、IKKi 相互作用形成復(fù)合物使下游 IRF3 與 IRF7 磷酸化后入核，，繼而誘導(dǎo) I 型干擾素和干擾素誘導(dǎo)基因（IRG）的表達(dá)來激活信號傳導(dǎo)通路（Sasai et al., 2010）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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本文編號：2584557