本文關(guān)鍵詞：弓形蟲新毒力基因TgMAPK1表達(dá)特性及其初步功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,它可以感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有哺乳動(dòng)物。弓形蟲感染給世界畜牧業(yè)和人類健康都帶來(lái)嚴(yán)重危害,作者先后對(duì)吉林省豬、錦州地區(qū)雞、遼寧絨山羊、遼西地區(qū)寵物犬進(jìn)行了弓形蟲感染情況調(diào)查,發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)畜禽弓形蟲感染較為嚴(yán)重,其防治工作迫在眉睫,然而目前弓形蟲病仍無(wú)較理想的防治藥物和安全有效的疫苗,所以尋找新型藥物治療靶標(biāo)和疫苗候選診斷抗原是當(dāng)前急需解決的科學(xué)問(wèn)題。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。已有研究證實(shí),MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可將細(xì)胞外的信號(hào)刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi),可調(diào)節(jié)諸如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化以及應(yīng)激反應(yīng)等重要生理過(guò)程。弓形蟲可編碼Tg MAPK1和Tg MAPK2,Tg MAPK1是一種p38αMAPK同源物,在機(jī)體受到外界刺激時(shí)表達(dá)或在體外速殖子轉(zhuǎn)化為緩殖子時(shí)表達(dá),與蟲體生長(zhǎng)發(fā)育和致病性密切相關(guān),是一種新的毒力因子,但其表達(dá)特性和基因功能還不完全清楚。為探究上述科學(xué)問(wèn)題,本研究克隆表達(dá)了弓形蟲Tg MAPK1:通過(guò)構(gòu)建弓形蟲Tg MAPK1原核表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得重組蛋白r Tg MAPK1,免疫小鼠制備抗r Tg MAPK1的小鼠多克隆抗體,應(yīng)用IFA技術(shù)檢測(cè)Tg MAPK1蛋白在弓形蟲速殖子的的表達(dá)部位。同時(shí)采用同源重組方法,以氯乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT)為篩選標(biāo)記,構(gòu)建弓形蟲Tg MAPK1基因打靶載體;以二氫葉酸還原酶(DHFR)為篩選標(biāo)記,構(gòu)建弓形蟲Tg MAPK1基因過(guò)表達(dá)載體;通過(guò)抗性篩選及相關(guān)鑒定,獲得弓形蟲Tg MAPK1缺失株和互補(bǔ)體蟲株;應(yīng)用免疫熒光、熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和納蟲空泡試驗(yàn)等方法手段研究弓形蟲MAPK1基因缺失后對(duì)其體內(nèi)和體外基因表型變化的影響,為鑒定弓形蟲病潛在藥物治療靶點(diǎn)及疫苗候選診斷抗原的研究奠定基礎(chǔ)。1.弓形蟲Tg MAPK1克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析RT-PCR擴(kuò)增Tg MAPK1編碼序列,目的片段大小為1599 bp。經(jīng)序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析,弓形蟲Tg MAPK1氨基酸序列與惡性瘧原蟲、毒害艾美爾球蟲和哈雷德原蟲等寄生原蟲的同源性高,但與人類和哺乳動(dòng)物間的同源性較低,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)而克隆表達(dá)了弓形蟲Tg MAPK1:構(gòu)建Tg MAPK1原核表達(dá)載體p ET-28a(+)-Tg MAPK1,重組蛋白(r Tg MAPK1)大小為58 ku。經(jīng)Ni-NTA純化后,將r Tg MAPK1免疫BALB/c小鼠制備了抗r Tg MAPK1的多克隆抗體,應(yīng)用IFA技術(shù)檢測(cè)Tg MAPK1在弓形蟲速殖子亞細(xì)胞定位。2.體外誘導(dǎo)緩殖子轉(zhuǎn)化時(shí)TgMAPK1的表達(dá)變化構(gòu)建體外弓形蟲速殖子誘導(dǎo)緩殖子轉(zhuǎn)化模型,應(yīng)用相對(duì)熒光定量QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件(高溫41℃,堿性p H8.1)下弓形蟲緩殖子期特異性蛋白BAG1、ENO1、 SAG2D、LDH2的表達(dá)變化,判斷體外誘導(dǎo)緩殖子的轉(zhuǎn)化效果,進(jìn)而檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件下Tg MAPK1蛋白的表達(dá)變化,明確弓形蟲Tg MAPK1對(duì)誘導(dǎo)分化的影響。3.弓形蟲Tg MAPK1缺失株及互補(bǔ)體蟲株的構(gòu)建利用PCR方法克隆弓形蟲Tg MAPK1基因兩側(cè)翼非編碼區(qū),以CAT為篩選標(biāo)記,構(gòu)建基因打靶載體pmin CAT-Tg MAPK1-UTR;再以DHFR為篩選標(biāo)記,構(gòu)建弓形蟲Tg MAPK1的過(guò)表達(dá)載體p DHFR-Tg MAPK1;將打靶載體線性化后電穿孔轉(zhuǎn)染弓形蟲Tg GT1株,經(jīng)氯霉素篩選獲得抗性單克隆蟲株,采用PCR、RT-PCR、Southern blotting和Western blotting等方法進(jìn)行鑒定。再將過(guò)表達(dá)載體p DHFR-Tg MAPK1電穿孔轉(zhuǎn)染至鑒定正確的Tg MAPK1缺失株內(nèi),經(jīng)乙胺嘧啶抗性篩選獲得抗性單克隆蟲株,再采用RT-PCR、Southern blotting和Western blotting方法進(jìn)行鑒定。4.弓形蟲Tg MAPK1的功能研究體外研究:在體外細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下,應(yīng)用IFA、QRT-PCR、FCS和納蟲空泡試驗(yàn)等方法比較弓形蟲Tg MAPK1缺失株(Tg MAPK1)、互補(bǔ)體蟲株(Tg Complement)與野生株(Tg GT1)在黏附、侵入、增殖、分化和抗原基因表達(dá)差異以及在巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)差異等試驗(yàn)鑒定MAPK1缺失對(duì)弓形蟲基因表型變化的影響。體內(nèi)研究:采用不同劑量Tg MAPK1、Tg Complement和Tg GT1的速殖子接種小鼠,統(tǒng)計(jì)分析小鼠的平均存活時(shí)間及存活小鼠肝、腦組織內(nèi)的蟲體數(shù)量,確定弓形蟲MAPK1對(duì)體內(nèi)致病性及增值的影響。采用BDTMCBA技術(shù)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)比較Tg MAPK1與Tg GT1在接種小鼠后第3天和第7天時(shí)血清和腹腔液內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)差異,推測(cè)MAPK1基因?qū)w內(nèi)細(xì)胞因子變化的影響。綜上,本研究得出以下結(jié)論:(1)序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析顯示弓形蟲MAPK1與包括人源在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的MAPK1親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明MAPK1基因可作為弓形蟲病藥物治療的候選基因和藥物作用靶點(diǎn)。(2)克隆并表達(dá)了弓形蟲Tg MAPK1,獲得了重組蛋白r Tg MAPK1及其多克隆抗體,并證明Tg MAPK1在弓形蟲速殖子細(xì)胞外膜上表達(dá)。(3)體外誘導(dǎo)緩殖子轉(zhuǎn)化時(shí)Tg MAPK1蛋白表達(dá)水平增高,且在誘導(dǎo)前期以及堿性誘導(dǎo)條件下差異顯著,推測(cè)堿性條件下弓形蟲的分化更依賴于MAPK1信號(hào)通路。(4)構(gòu)建了弓形蟲TgMAPK1基因打靶載體和過(guò)表達(dá)載體,經(jīng)電轉(zhuǎn)、抗性篩選及PCR、RT-PCR、Southern、Western等鑒定,成功獲得弓形蟲Tg MAPK1缺失株和互補(bǔ)體蟲株。(5)體外研究表明:粘附侵入試驗(yàn)表明MAPK1缺失能降低弓形蟲速殖子對(duì)宿主細(xì)胞的粘附能力但對(duì)侵入無(wú)影響;增殖試驗(yàn)表明MAPK1缺失可以減緩弓形蟲速殖子的增殖;誘導(dǎo)分化試驗(yàn)表明MAPK1缺失可降低弓形蟲速殖子向緩殖子的轉(zhuǎn)化效力;基因表達(dá)差異試驗(yàn)表明MAPK1基因?qū)蜗xSAG3、GRA1及MICs基因的表達(dá)呈負(fù)調(diào)控作用,對(duì)ROPs基因的表達(dá)呈正調(diào)控作用。巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)差異試驗(yàn)表明MAPK1基因可能是通過(guò)調(diào)控TNF、IL-6、IL-10的表達(dá)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化。(6)體內(nèi)研究表明:小鼠體內(nèi)致病性試驗(yàn)表明MAPK1缺失可降低弓形蟲對(duì)小鼠的致病力,降低其在小鼠體內(nèi)增殖速度,表明Tg MAPK1是弓形蟲的一種新的毒力基因。腹腔液中細(xì)胞因子表達(dá)差異試驗(yàn)表明MAPK1基因可能是通過(guò)調(diào)控IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IL-10的表達(dá)而促進(jìn)腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞活化,進(jìn)而殺滅弓形蟲。血清中細(xì)胞因子表達(dá)差異試驗(yàn)表明MAPK1基因可能是通過(guò)調(diào)控IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的表達(dá)而促使機(jī)體由Th2型免疫應(yīng)答向Th1型的轉(zhuǎn)變,從而建立潛伏感染或慢性感染。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 絲裂原活化蛋白激酶1 TgMAPK1 基因敲除 基因功能
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-14
• 前言14-15
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述15-23
• 1 弓形蟲與弓形蟲病15-17
• 2 MAPK的研究進(jìn)展17-22
• 3 本研究的目的與意義22-23
• 第二篇 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容23-108
• 第一章 弓形蟲MAPK1基因克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析23-49
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-37
• 1.3 結(jié)果37-47
• 1.4 討論47-48
• 1.5 小結(jié)48-49
• 第二章 弓形蟲誘導(dǎo)緩殖子過(guò)程中MAPK1表達(dá)水平研究49-58
• 2.1 材料49-50
• 2.2 方法50-52
• 2.3 結(jié)果52-56
• 2.4 討論56
• 2.5 小結(jié)56-58
• 第三章 弓形蟲MAPK1缺失株及互補(bǔ)體蟲株構(gòu)建及鑒定58-79
• 3.1 材料58-59
• 3.2 方法59-69
• 3.3 結(jié)果69-77
• 3.4 討論77-78
• 3.5 小結(jié)78-79
• 第四章 弓形蟲MAPK1缺失對(duì)其體外生長(zhǎng)發(fā)育的影響79-97
• 4.1 材料79
• 4.2 方法79-87
• 4.3 結(jié)果87-94
• 4.4 討論94-96
• 4.5 小結(jié)96-97
• 第五章 弓形蟲MAPK1缺失對(duì)其體內(nèi)致病性的影響97-108
• 5.1 材料97
• 5.2 方法97-99
• 5.3 結(jié)果99-103
• 5.4 討論103-106
• 5.5 小結(jié)106-108
• 結(jié)論108-109
• 參考文獻(xiàn)109-121
• 附錄121-124
• 作者簡(jiǎn)介124-125
• 致謝125

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張愛(ài)梅;弓形蟲基因型Chinese 1不同毒力的分離株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞偏移應(yīng)答的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：弓形蟲新毒力基因TgMAPK1表達(dá)特性及其初步功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：258363