【摘要】：團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala),俗稱武昌魚,是我國(guó)一類重要的大宗淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。最近幾年由于養(yǎng)殖密度不斷的擴(kuò)大以及生態(tài)環(huán)境的惡化等原因,各類疾病頻發(fā)。在這其中,由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的細(xì)菌性敗血癥對(duì)于團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)的危害最大。到目前為止還沒有有效的預(yù)防和治療措施。MicroRNAs(miRNAs)是一類在免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用的非編碼小的單鏈RNA分子。但是到目前為止關(guān)于團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌相關(guān)的miRNAs研究未見報(bào)道。為了更好的了解miRNA在團(tuán)頭魴抵抗嗜水氣單胞菌感染中的重要作用,我們首先通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)團(tuán)頭魴肝臟組織未感染嗜水氣單胞菌(0 h)和感染后4 h、24 h的miRNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,鑒定篩選了與團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌免疫相關(guān)的mi RNAs。隨后對(duì)篩選的免疫相關(guān)miRNAs其調(diào)控關(guān)系和功能做了進(jìn)一步的分析鑒定。主要研究結(jié)果如下:1.通過高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了團(tuán)頭魴肝臟組織未感染嗜水氣單胞菌(0 h)和感染后4 h、24 h 3個(gè)小RNA庫。通過分析分別獲得了11,244,207條、9,212,958條和7,939,157條clean reads。通過生物信息學(xué)分析鑒定到171個(gè)保守的miRNAs和62個(gè)新的miRNAs。通過RT-PCR,我們隨機(jī)驗(yàn)證了10個(gè)新的miRNAs的存在。差異表達(dá)miRNAs分析發(fā)現(xiàn),分別有61個(gè)和44個(gè)miRNAs在感染后4 h和24 h呈顯著上調(diào)或者下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)。隨后通過熒光定量PCR檢測(cè)了隨機(jī)挑選的9個(gè)miRNAs,它們?cè)趫F(tuán)頭魴肝臟感染嗜水氣單胞菌后的表達(dá)模式與高通量測(cè)序結(jié)果一致。差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測(cè)和靶基因Gene Ontology(GO)、Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes(KEGG)注釋的分析結(jié)果表明嗜水氣單胞菌能夠影響團(tuán)頭魴的多種生物學(xué)通路。在預(yù)測(cè)的靶基因中共鑒定到94個(gè)免疫相關(guān)的基因。通過熒光定量PCR檢測(cè)了隨機(jī)篩選的免疫相關(guān)miRNAs在團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后肝臟中的表達(dá)模式。最后,通過雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了這些miRNAs與其相應(yīng)靶基因的關(guān)系。由以上結(jié)果推測(cè)差異表達(dá)miRNAs可能通過調(diào)控相應(yīng)的靶基因進(jìn)而參與了抵抗細(xì)菌入侵的免疫反應(yīng)。這些研究結(jié)果加深了我們對(duì)于miRNA在團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后免疫反應(yīng)中重要作用的認(rèn)識(shí),同時(shí)也可以促進(jìn)開發(fā)有效的疾病預(yù)防措施和分子標(biāo)記,為團(tuán)頭魴抗病育種提供理論基礎(chǔ)。2.差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFR)是miR-375的靶基因。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)感染嗜水氣單胞菌后團(tuán)頭魴肝臟中TF和TFR的表達(dá)顯著上調(diào),而miR-375發(fā)生顯著下調(diào),miR-375與靶基因呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢(shì)。隨后通過過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-375通過作用于TF和TFR的3’UTR從而抑制其表達(dá)。基于TF和TFR在鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的重要作用,我們由此推測(cè),miR-375在團(tuán)頭魴鐵穩(wěn)態(tài)和抵抗細(xì)菌入侵中發(fā)揮著重要的作用。3.差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-146a、miR-29a和miR-457b-5p共同靶向作用于TRAF6基因的3’UTR。雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-146a和miR-29a可以靶向作用于TRAF6基因的3’UTR。隨后在團(tuán)頭魴鰭條細(xì)胞中過表達(dá)或者抑制miR-146a和miR-29a后,TRAF6相應(yīng)的受到抑制或者出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了TRAF6是mi R-146a和mi R-29的直接靶標(biāo)。另外,我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌感染后,肝臟、脾臟和腎臟組織中miR-146a、miR-29a和TRAF6蛋白表達(dá)均有顯著變化,總體上均是先升高后下降。LPS刺激CIK細(xì)胞后,miR-146a和miR-29a均出現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì),在12 h到達(dá)最高,最后在48 h恢復(fù)至正常水平。因此推測(cè)miR-146a和miR-29a在魚體抵抗細(xì)菌感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。此外,在CIK細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a和miR-29a后,TLR/NF-κB下游免疫相關(guān)基因NF-κB p65、NF-κB p52、IL-6和TNF-α均受到抑制,其中miR-146a對(duì)IL-6沒有顯著的抑制作用。在CIK細(xì)胞中敲降miR-146a和miR-29a后,用LPS刺激后發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的下游基因發(fā)生顯著上調(diào)。綜上推測(cè),miR-146a和miR-29a作為負(fù)調(diào)控因子通過靶向調(diào)控TRAF6基因,進(jìn)而參與調(diào)控TLR/NF-κB信號(hào)通路,在魚體先天性免疫反應(yīng)中起到重要的作用。
【圖文】：

miRNA的生成和作用（Zanetal2014）

-2 莖環(huán)引物法檢測(cè) miRNA 表達(dá)原理圖（Chen et al 2 Schematic for stem-loop RT-PCR for miRNA（Chen et a術(shù)術(shù)（miRNA microarray）是一類快捷、靈敏度高 miRNA 及其表達(dá)模式的技術(shù)。它是高通量測(cè)序且已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于探究 miRNA 在發(fā)育（Roroce 2009）和疾病發(fā)生（Latronico and Condor但是其劣勢(shì)主要是不能對(duì) miRNA 進(jìn)行絕對(duì)定Rosa and Brivanlou 2009）。術(shù)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2570415