【摘要】：本文旨在鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞micro RNA(以下簡稱mi RNA)的表達(dá)譜,研究高脂和低脂奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞mi RNA的表達(dá)譜差異,探討mi RNA調(diào)控奶牛乳脂合成的分子機(jī)制。首先篩選乳脂率差異顯著的中國荷斯坦奶牛各3頭,利用組織塊接種法分離培養(yǎng)兩種具有不同乳脂合成特性的原代乳腺上皮細(xì)胞(primary mammary gland epithelial cell,p MEC),并對其生物學(xué)特性及甘油三酯含量進(jìn)行鑒定。然后,在成功構(gòu)建兩細(xì)胞小RNA文庫的基礎(chǔ)上,利用Solexa測序及生物信息學(xué)分析技術(shù)對mi RNA在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)模式進(jìn)行鑒定,分析兩細(xì)胞mi RNA的表達(dá)譜差異。最后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)、種子定點(diǎn)突變技術(shù)、莖環(huán)q RT-PCR及Western Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證手段對兩細(xì)胞文庫差異表達(dá)、且與乳脂代謝相關(guān)的mi RNA及其候選靶基因和功能進(jìn)行驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1.篩選獲得乳脂率性狀差異顯著的中國荷斯坦奶牛各3頭,首先利用組織塊接種法分離和培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞,分別命名為p MEC-HH(高脂奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞)和p MEC-LL(低脂奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞)。分離純化后,通過生長曲線、特異性分泌蛋白的RT-PCR及免疫熒光、染色體核型分析等生物學(xué)鑒定手段,獲得了大量具有正常表型和生物學(xué)特性的奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞。甘油三酯含量測定結(jié)果顯示兩細(xì)胞的乳脂含量差異顯著,說明體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞保留了活體乳腺組織乳脂的合成和分泌特性。2.利用Solexa高通量測序技術(shù)鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞的mi RNA表達(dá)譜,結(jié)果共鑒定出292個牛已知保守mi RNA,其中252個mi RNA在兩細(xì)胞中共表達(dá),17個mi RNA/mi RNA*僅在p MEC-HH中表達(dá),21 mi RNA/mi RNA*僅在p MEC-LL中表達(dá);共鑒定出116個新的候選mi RNA,其中32個mi RNA在兩細(xì)胞中共表達(dá),80個mi RNA僅在p MEC-HH中表達(dá),84個mi RNA僅在p MEC-LL中表達(dá)。3.兩文庫表達(dá)譜差異分析結(jié)果顯示,共鑒定出97個差異表達(dá)的已知mi RNAs(p0.05),其中有91個mi RNA在兩文庫中共表達(dá);與p MEC-HH相比,38個mi RNA在p MEC-LL中表達(dá)上調(diào),59個mi RNA在p MEC-LL中表達(dá)下調(diào);差異表達(dá)的97個已知mi RNA候選靶基因的GO和KEGG功能注釋分析結(jié)果表明,兩文庫共預(yù)測到9887個候選靶基因,注釋到305個生物過程。其中與脂代謝相關(guān)的通路中脂肪酸代謝注釋到61個基因,脂肪酸的生物合成注釋到13個,脂肪酸碳鏈的延長注釋到32個,不飽和脂肪酸的生物合成注釋到28個。4.利用莖環(huán)qPCR方法,驗(yàn)證了13個已知mi RNA在乳腺上皮細(xì)胞和乳腺組織的表達(dá)量,并將結(jié)果與Solexa測序結(jié)果進(jìn)行比對,三者mi RNA差異表達(dá)的趨勢具有高度一致性,表明細(xì)胞水平mi RNA鑒定的敏感性和可行性。5.利用靶基因預(yù)測和功能注釋等生物學(xué)分析技術(shù)以及莖環(huán)q PCR和Western Blot的試驗(yàn)驗(yàn)證手段,篩選出4個與乳脂代謝調(diào)控有關(guān)的差異表達(dá)mi RNA,分別是:bta-mi R-33a,候選靶基因ELOVL5、ELOVL6;bta-mi R-21*,候選靶基因ELOVL5和PTGIS;bta-mi R-152,候選靶基因PTGS2、PRKAA1和UCP3;bta-mi R-224,候選靶基因是LPL、GST和ALOX15。6.利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)對篩選獲得的bta-mi R-152進(jìn)行靶基因鑒定及功能驗(yàn)證研究,結(jié)果表明bta-mi R-152可以通過特異性地靶向結(jié)合UCP3基因,影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯含量,但細(xì)胞活性在轉(zhuǎn)染前后無顯著差異,證明bta-mi R-152可作為探討奶牛乳脂代謝調(diào)控機(jī)制的重要候選mi RNA。成功構(gòu)建了高脂和低脂奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞,二者mi RNA的表達(dá)譜差異顯著。篩選獲得4個參與調(diào)控奶牛乳脂合成代謝的mi RNA,分別是bta-mi R-33a、bta-mi R-21*、bta-mi R-152和bta-mi R-224。進(jìn)一步的靶基因鑒定和功能驗(yàn)證研究表明bta-mi R-152可以通過靶向識別UCP3基因,影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂的合成和代謝。
【圖文】：

圖 1.1 奶牛乳腺乳脂合成及調(diào)控機(jī)制示意圖Figure 1.1 The regular mechanisms of milk fat synthesis in bovine mammary tissue圖片摘自 Bional 等（2008）[2]1.1 脂肪酸從頭合成

圖 2.1 miR-33 調(diào)控脂代謝機(jī)制示意圖Figure 2.1 The diagram of miR-33 regulating the lipid metabolismmiR-33可抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸氧化過程中涉及的相關(guān)基因表達(dá)。圖片引自GIGLI等（2013）[61]。基因英文全稱見論文英文字母縮略表。miR-33 represses the expression of genes involved in cholesterol export and fatty acid
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
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本文編號：2565977