【摘要】：三疣梭子蟹是我國(guó)重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類。近年來,三疣梭子蟹養(yǎng)殖受到寄生性甲藻類病原-血卵渦鞭蟲引發(fā)的流行病害“牛奶病”的嚴(yán)重危害,其可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅。寄生性甲藻類病原-血卵渦鞭蟲在世界范圍內(nèi)可寄生感染多種重要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物,其發(fā)生范圍及感染宿主種類有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì),不僅影響了重要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物的野生群體及其漁業(yè)產(chǎn)業(yè),也開始危害重要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前,針對(duì)該寄生性甲藻-血卵渦鞭蟲的相關(guān)研究大多集中于物種鑒定、檢測(cè)技術(shù)、流行病學(xué)等方面,尚缺乏病原宿主相互作用等基礎(chǔ)研究工作。因此,本論文從宿主免疫響應(yīng)的角度出發(fā),系統(tǒng)研究了甲殼宿主-三疣梭子蟹與寄生性甲藻類病原-血卵渦鞭蟲的相互作用過程,以期進(jìn)一步豐富和完善甲殼動(dòng)物免疫機(jī)制的基礎(chǔ)理論,同時(shí)為寄生性甲藻類病原引發(fā)的養(yǎng)殖病害的防控提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.克隆獲得三疣梭子蟹Toll基因的全長(zhǎng)cDNA序列,全長(zhǎng)為3745bp,開方閱讀框?yàn)?012bp,編碼1003個(gè)氨基酸,其編碼氨基酸序列與擬穴青蟹和鋸緣青蟹中的Toll序列相似性高達(dá)88%,并在系統(tǒng)發(fā)育樹中優(yōu)先與甲殼動(dòng)物Tolls序列聚為一枝。Toll基因在三疣梭子蟹體內(nèi)廣泛表達(dá)且在血細(xì)胞中的表達(dá)豐度最高。在血卵渦鞭蟲的侵染早期(侵染24 h內(nèi)),Toll基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在三疣梭子蟹的血細(xì)胞、鰓、心臟和肌肉組織中受到顯著性抑制,反映出該寄生性病原可能對(duì)其甲殼宿主體內(nèi)的Toll免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有一定的抑制作用,而該抑制過程也可能與該寄生性甲藻類病原在甲殼宿主體內(nèi)的存活及寄生過程密切相關(guān)。之后,Toll基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在受到侵染48 h時(shí)的血細(xì)胞和心臟組織以及受到侵染48 h和96 h時(shí)的肝胰腺組織中顯著上調(diào),可能反映了甲殼動(dòng)物Toll基因在相應(yīng)時(shí)間階段對(duì)血卵渦鞭蟲的免疫防御作用。最后,經(jīng)血卵渦鞭蟲侵染192 h時(shí),Toll基因在血細(xì)胞、肝胰腺和肌肉組織中的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào),可能表明該寄生性病原在侵染后期已逐步破壞其宿主體內(nèi)Toll受體介導(dǎo)的免疫信號(hào)途徑的免疫防御功能。2.血卵渦鞭蟲的侵入可顯著影響三疣梭子蟹血細(xì)胞和肝胰腺組織中proPO基因的轉(zhuǎn)錄水平及酚氧化酶活力水平,并可誘導(dǎo)proPO基因表達(dá)水平和酚氧化酶活力水平顯著上調(diào),表明三疣梭子蟹proPO系統(tǒng)在對(duì)血卵渦鞭蟲的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。同時(shí),血卵渦鞭蟲可顯著抑制三疣梭子蟹propo系統(tǒng)中重要誘導(dǎo)和激活因子(lgbp和ppaf)以及propo基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),反映出該寄生性病原可能對(duì)三疣梭子蟹的propo系統(tǒng)的激活過程具有一定的免疫抑制作用。另外,血卵渦鞭蟲可導(dǎo)致三疣梭子蟹體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量(thcs和dhcs)的顯著下降,并可在侵染后期(侵染16d和24d)造成肝胰腺組織的顯著病理學(xué)變化。3.血卵渦鞭蟲侵染后,三疣梭子蟹體內(nèi)3個(gè)重要clip-domain絲氨酸蛋白酶基因(ptcsp1-3)以及2個(gè)重要蛋白酶抑制劑基因(a2m和serpin)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均發(fā)生顯著性變化,反映出三疣梭子蟹體內(nèi)的sps級(jí)聯(lián)反應(yīng)受到血卵渦鞭蟲入侵的嚴(yán)重干擾,并可能在甲殼宿主-三疣梭子蟹應(yīng)對(duì)該寄生性病原的免疫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。ptcsp1-3基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)變化模式,反映出它們可能在應(yīng)對(duì)血卵渦鞭蟲免疫響應(yīng)過程中執(zhí)行不同的生物學(xué)功能,同時(shí)結(jié)合propo基因表達(dá)水平和酚氧化酶活力的變化結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),ptcsp1和ptcsp3蛋白酶可能是三疣梭子蟹propo系統(tǒng)中的重要組成成員,參與調(diào)控propo系統(tǒng)的激活過程。4.克隆獲得三疣梭子蟹的no/o2·--合成關(guān)鍵酶基因nos、nox以及三疣梭子蟹的抗氧化基因gpx的cdnas序列。其中,三疣梭子蟹nos基因cdna序列全長(zhǎng)為4002bp,開方閱讀框?yàn)?612bp,編碼1203個(gè)氨基酸,其編碼氨基酸序列與甲殼動(dòng)物nos序列具有較高的相似性(79%),并在系統(tǒng)發(fā)育分析樹中優(yōu)先與甲殼動(dòng)物nos序列聚在一起。組織表達(dá)分析結(jié)果表明,nos、nox和gpx基因在三疣梭子蟹的血細(xì)胞和肝胰腺組織中的表達(dá)量較高。對(duì)三疣梭子蟹進(jìn)行血卵渦鞭蟲人工侵染0-192h后,no/o2·--合成和清除相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(nos、nox、cuznsod、cat和gpx)及對(duì)應(yīng)的酶活力水平(nos、nox、sod、cat和gpx)在血細(xì)胞和肝胰腺組織中均發(fā)生顯著性變化,反映了no/o2·--合成系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)在甲殼宿主-三疣梭子蟹對(duì)血卵渦鞭蟲免疫反應(yīng)中的重要作用。自由基no/o2·-合成系統(tǒng)可能參與并促進(jìn)了甲殼宿主對(duì)血卵渦鞭蟲的免疫防御過程,而抗氧化系統(tǒng)在免疫響應(yīng)過程中的ros水平調(diào)控及宿主自我防護(hù)過程中發(fā)揮重要作用。綜上所述,本論文以三疣梭子蟹與寄生性甲藻類病原-血卵渦鞭蟲的侵染體系為研究對(duì)象,首次從宿主免疫響應(yīng)的角度出發(fā),初步探究和闡述了甲殼動(dòng)物宿主與寄生性甲藻類病原-血卵渦鞭蟲的宿主病原相互作用過程。本論文有助于豐富甲殼動(dòng)物免疫防御機(jī)制的基礎(chǔ)理論研究,并為預(yù)防和控制寄生性甲藻類病原引發(fā)的海產(chǎn)蝦、蟹類流行性疾病提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 血卵渦鞭蟲在全球范圍內(nèi)的分布。Fig. 1-1 global distribution of Hematodinium spp. (Small, 2012).

目前血卵渦鞭蟲分布在我國(guó)和俄羅斯地區(qū)。在我國(guó)近海，，血卵渦鞭要分布于山東半島、浙江舟山群島、浙江溫州及廣東汕頭等多個(gè)地區(qū)（圖 1-2），并為引發(fā)我國(guó)多種海產(chǎn)養(yǎng)殖蟹類病害的重要病原之一。2006 年，許文軍等首次報(bào)道了渦鞭蟲對(duì)浙江舟山養(yǎng)殖三疣梭子蟹的感染，并確定其為引發(fā)三疣梭子蟹養(yǎng)殖病害“
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S945

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2550958