【摘要】：G蛋白以其結(jié)合并水解GTP的能力參與到幾乎所有的細(xì)胞調(diào)控途徑中。與異源三聚體G蛋白不同,小G蛋白為具有GTP水解活力的單體。spoOB相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白(spoOB-associated GTP-binding protein,Obg)家族中的 YchF(ribosome-binding ATPase)亞家族,是高度保守的核心亞家族小G蛋白,存在于所有生物體中。非常規(guī)G4motif的存在使YchF亞家族失去了核苷酸結(jié)合的特異性。目前,文獻(xiàn)所報(bào)道的細(xì)菌、酵母和人源YchF蛋白都被確定為一種ATP水解酶。水稻是世界上主要的糧食作物之一,病原菌侵染和鹽堿脅迫可以導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量急劇下降,而水稻中的YchF蛋白OsYchF1負(fù)調(diào)控植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)和鹽脅迫響應(yīng)。與其它YchF同源蛋白明顯不同的是OsYchF1具有相同的ATP、GTP結(jié)合和水解能力。但是OsYchF1既能識(shí)別ATP又能識(shí)別GTP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、分子機(jī)制和生物學(xué)功能尚不清楚。闡明OsYchF1參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制,對(duì)人們利用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)子來(lái)獲得對(duì)生物和非生物逆境廣譜且持久的抗性具有重要意義。本論文首先通過(guò)大量篩選獲得OsYchF1蛋白晶體,利用分子置換法以人源類似Obg家族G蛋白的ATP水解酶1(humanObg-likeATPase 1,hOLA1)為模板解析了弱酸性條件下的apo-OsYchF1結(jié)構(gòu)。Apo-OsYchF1作為植物中第一個(gè)被解析出來(lái)的YchF同源蛋白,具有YchF亞家族蛋白保守的結(jié)構(gòu)域折疊類型,包括G結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域和TGS結(jié)構(gòu)域。在功能區(qū)域G2/switchⅠ、G3/switchⅡ以及LoopA則與其它同源蛋白存在較大差異。核苷酸結(jié)合滴定實(shí)驗(yàn)和水解活力實(shí)驗(yàn)證實(shí)異源表達(dá)的OsYchF1具有較低且相似地ATP/GTP結(jié)合水解能力。隨后利用共結(jié)晶的方法解析了 OsYchF1-AMPPNP(ATP類似物)復(fù)合物和OsYchF1-GMPPNP(GTP類似物)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析顯示:OsYchF1對(duì)AMPPNP的結(jié)合主要來(lái)自對(duì)腺嘌呤堿基的識(shí)別作用力;OsYchF1對(duì)GMPPNP的結(jié)合主要來(lái)自對(duì)磷酸基團(tuán)的作用力。OsYchF1對(duì)GTP的結(jié)合方式與其它G蛋白明顯不同,表現(xiàn)為鳥嘌呤堿基在OsYchF1堿基結(jié)合口袋處結(jié)合得非常淺,主要是通過(guò)水分子介導(dǎo)的氫鍵與OsYchF1的G4、G5 motif作用。此外,GMPPNP的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致OsYchF1的G3/switch Ⅱ區(qū)域發(fā)生顯著性的結(jié)構(gòu)重排。根據(jù)復(fù)合物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的OsYchF1的G4 motif突變蛋白(OsYchF1-G4'),失去結(jié)合水解ATP的能力而保留了結(jié)合水解GTP的能力。最后,本論文解析了apo-OsYchF1在弱堿性條件下的結(jié)構(gòu)。通過(guò)比對(duì)弱酸弱堿條件下apo-OsYchF1的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)僅將pH由6.5變化到7.2就可以誘導(dǎo)G3/switch Ⅱ區(qū)域α3螺旋的形成和α4螺旋向核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的擺動(dòng)。因此,OsYchF1的功能區(qū)域G3/switch Ⅱ具有pH依賴的構(gòu)象變化過(guò)程。本論文闡明了 OsYchF1具有結(jié)合ATP和GTP雙重特異性的分子機(jī)制,根據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的OsYchF1-G4'為研究OsYchF1利用結(jié)合不同的核苷酸而參與不同植物應(yīng)激反應(yīng)途徑創(chuàng)造了合理的條件。弱酸弱堿條件下apo-OsYchF1的結(jié)構(gòu)變化說(shuō)明細(xì)胞pH值可以影響OsYchF1功能的行使。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為利用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)子OsYchF1來(lái)提高水稻對(duì)生物和非生物逆境的耐受性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
【圖文】：

農(nóng)業(yè)大學(xué)博±學(xué)位論文邐第一章所有Ｇ蛋白都含有保守的基本ＧＴＰ結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即Ｇ結(jié)構(gòu)域（Ｇ邋ｄｏｍａｉｎ），行使其水成ＧＤＰ的功能。Ｇ結(jié)構(gòu)域是一個(gè)典型的（Ｘ，Ｐ核昔酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由六條混合的Ｐ折疊布在其兩側(cè)的五個(gè)ａ螺旋紐成。一些保守的序列元件（Ｇ１－Ｇ５邋ｍｏｔｉｆ）構(gòu)成其核昔酸結(jié)中Ｇ４和Ｇ５邋ｍｏｔｉｆ主要負(fù)責(zé)識(shí)別鳥嘿吟堿基，常規(guī)的Ｇ４邋ｍｏｔｉｆ序列Ｎ／ＴＫｘＤ保證了邋Ｇ鳥嚷吟堿基識(shí)別的特異性；Ｇ１邋ｍｏｔｉｆ／Ｐ－ｌｏｏｐ主要負(fù)責(zé)x鎪嶧諾慕岷希唬牽插澹恚錚簦椋媯螅鰨椋簦悖楨澹桑沖澹恚錚簦椋茫螅鰨椋簦悖瑁歟熘饕涸穡停紓璧畝ㄎ�、吭Ｐ的水解＾ＧG奔昂推淥вζ饕蜃擁南嗷ィ椋簦簦椋畎啵錚媯澹蟈澹幔睿溴澹鄭澹簦簦澹潁�，２０１１）（图邋＾莻悖辶x

本文編號(hào)：2544737