【摘要】：脊椎動(dòng)物白介素17是一類重要的促炎細(xì)胞因子,可參與免疫防御和組織損傷修復(fù)等過程,對平衡機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。適度的炎癥反應(yīng)是機(jī)體抵抗外界環(huán)境脅迫的自我保護(hù)措施,過度的炎癥反應(yīng)則會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂,產(chǎn)生自身免疫性疾病。目前在軟體動(dòng)物已有炎癥反應(yīng)的少量報(bào)道,但相關(guān)研究尚處于觀察實(shí)驗(yàn)階段,白介素17等促炎細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中的作用尚不明確。本論文以長牡蠣為研究對象,采用分子生物學(xué),細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等技術(shù),篩選并克隆了長牡蠣中白介素17及其信號(hào)通路相關(guān)分子,分析了其結(jié)構(gòu)和功能特征,初步探討了它們在環(huán)境脅迫應(yīng)答中的的調(diào)節(jié)機(jī)制。在長牡蠣基因組中篩選出了10個(gè)白介素17分子,命名為CgIL17-1～CgIL17-10,分子間同源度較低,但在氨基酸序列的C端都具有4個(gè)非常保守的半胱氨酸位點(diǎn),能形成類似于脊椎動(dòng)物白介素17中所含半胱氨酸結(jié)節(jié)的三維結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明無脊椎與脊椎動(dòng)物中的白介素17分子間存在顯著差異,長牡蠣白介素17分子屬于無脊椎動(dòng)物白介素17大家族。10個(gè)分子廣泛分布于長牡蠣各組織中,其中以鰓,外套膜和肝胰腺中表達(dá)量較高。10個(gè)分子在長牡蠣個(gè)體發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式各不相同。CgIL17-5在成體中表達(dá)水平較高且在菌刺激后表達(dá)量顯著上升,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其不僅能激活免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)IL6的合成,而且具有PAMPs (LPS, PGN, poly (I:C)和β-1,3-glucan)結(jié)合活性,并能抑制藤黃微球菌和大腸桿菌的生長,對L929細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒害作用,是一個(gè)兼具信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和模式識(shí)別受體效應(yīng)的多功能分子。在長牡蠣基因組中篩選出6個(gè)含有保守SEFIR結(jié)構(gòu)域的分子,命名為CgSEFIR1～CgSEFIR6。其中CgSEFIR2和CgSEFIR4含有跨膜結(jié)構(gòu)域,CgSEFIR6結(jié)構(gòu)較為特殊,除C端保守的SEFIR結(jié)構(gòu)域,在N端還含有一個(gè)DD結(jié)構(gòu)域,與MyD88分子相似,結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明這些分子可能參與白介素17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,6個(gè)CgSEFIR分子可以分為兩類,一類與脊椎動(dòng)物白介素17受體IL-17RD類似(CgSEFIR1,CgSEFIR2和CgSEFIR3),一類與接頭蛋白CIKS類似(CgSEFIR4, CgSEFIR5和CgSEFIR6).基因共線性分析進(jìn)一步表明牡蠣中受體類CgSEFIR與脊椎動(dòng)物五大類白介素受體中的IL-17RD相似度更高。mRNA原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示,4個(gè)CgSEFIR分子(CgSEFIR1, CgSEFIR3, CgSEFIR5和CgSEFIR6)主要分布于肝胰腺小管,在鰓絲中有少量分布。LPS和PGN刺激后CgSEFIR1, CgSEFIR3和CgSEFIR6 mRNA表達(dá)量顯著升高,而CgSEFIR5在LPS刺激后表達(dá)水平顯著降低。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)對4個(gè)CgSEFIR分子間及與CgTRAF6分子相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)CgSEFIR5只與CgTRAF6司存在一定的相互作用,而CgSEFIR6除與CgTRAF6存在相互作用,還可以分別與CgSEFIR1和CgSEFIR3相互作用。雙熒光實(shí)驗(yàn)表明,CgSEFIR1和CgSEFIR6的過表達(dá)均可以激活NF-kB信號(hào)通路,且CgSEFIR5和CgSEFIR6可以一定程度減弱MyD88對NF-kB信號(hào)通路的激活。發(fā)現(xiàn)在CgSEFIR1, CgSEFIR3和CgSEFIR6被干擾后,長牡蠣體內(nèi)CgIL17誘導(dǎo)的下游CgAIF和CgMIF基因表達(dá)量顯著降低,而在CgSEFIR5被干擾后,CgIL17對下游基因的誘導(dǎo)作用未見顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)長牡蠣血清中葡萄糖含量在干露后第三天開始顯著上升,CgIL17-1和CgIL17-5表達(dá)量也顯著升高。體內(nèi)注射高劑量葡萄糖后發(fā)現(xiàn),CgIL17-1和CgIL17-5基因表達(dá)量增加。通過組織切片觀察發(fā)現(xiàn),干露時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致牡蠣肝胰腺中小管管壁變薄,管腔變大,外套膜中神經(jīng)纖維萎縮,肌肉纖維退化。體內(nèi)直接注射重組蛋白CgIL17-1和CgIL17-5后,發(fā)現(xiàn)長牡蠣中肝胰腺小管發(fā)生了與干露脅迫下相同的形態(tài)學(xué)變化,同時(shí)GSK3β的含量顯著下降。CgIL17-1和CgIL17-5基因干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其對GSK3β的抑制作用,且兩基因分別被干擾后抗菌肽CgDefensin及與促凋亡相關(guān)的CgDAFF基因表達(dá)量顯著降低,而與抑制凋亡相關(guān)的基因CgIAP表達(dá)量上升。同時(shí),在CgIL17-1和CgIL17-5基因被干擾后,在干露的前三天長牡蠣的存活率降低,而在干露后期長牡蠣的存活率一定程度增加。綜上所述,在軟體動(dòng)物長牡蠣中克隆獲得了白介素17家族成員及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,它們具有與高等動(dòng)物中同源分子相似的結(jié)構(gòu)和功能,同樣可參與到機(jī)體免疫防御和響應(yīng)外界非生物脅迫過程中,在維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。白介素17可作為長牡蠣健康狀態(tài)的潛在指示分子,白介素17及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子的研究為長牡蠣的病害防控提供重要的理論指導(dǎo)。
【圖文】：

ｆｏｌｄ）氣逡逑ｌｉｔ逡逑圖１－２半脯氨酸結(jié)節(jié)（ｃｙｓｔｉｎｅ邋ｋｎｏｔ邋ｆｏｌｄ）示意圖［２７］逡逑注：Ａ，Ｌ－ＨＦ單體結(jié)構(gòu)：Ｂ，聚體結(jié)拘；Ｃ．邋ＮＧＦ－ＴｒｋＡ復(fù)合體結(jié)構(gòu)逡逑４逡逑

ｔｏ邋００逡逑ＳｕｂｔＭｕｔｉｏｒｔｓ邋ｐｅｒ邋１的邋Ｒｅｃｄｕｅｓ逡逑圖１－１白介素１７分子進(jìn)化挪Ｗ邐－逡逑二、邋白介素１７家族分子結(jié)構(gòu)特征逡逑鑒于宿主與病原之間的持續(xù)競爭和相互進(jìn)化，，白介素類免疫相關(guān)細(xì)胞因子都逡逑ｒ邐經(jīng)歷了較大的變異過程，序列差異大：且白介素類細(xì)胞因子功能具有多效性，不逡逑同白介素類細(xì)胞因子間功能具有重疊性。因此，難從序列和功能的角度對白介逡逑素類細(xì)胞因子進(jìn)行歸類ＰＷ。晶體學(xué)數(shù)據(jù)的遞增和保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，為該類分子逡逑聚類提供了新方法。根據(jù)顯著的結(jié)構(gòu)特征差異，白介素類細(xì)胞因子可＾方聚類為四逡逑種。類型Ｉ，止－１類分子，折疊中富含ｅ片層結(jié)構(gòu)被稱為Ｐ－蘭葉草（ｐ－ｔｒｅｆｏｉｌ）；逡逑類型ＩＩ，與ｒ鏈?zhǔn)荏w相結(jié)合的白介素類分子及ＩＬ４／ＩＬ６類分子，具有四個(gè)緊密折逡逑疊的ａ螺旋被稱為四螺旋束結(jié)構(gòu)域；類型ＩＩＩ
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2543889