【摘要】：疾病是困擾當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要難題,而從遺傳本質(zhì)上提高豬抗病性能是解決這一問題的關(guān)鍵�？共⌒誀疃鄬儆趶�(fù)雜性狀且易受環(huán)境影響,存在許多經(jīng)典遺傳學(xué)無法解釋的現(xiàn)象。表觀遺傳學(xué)的發(fā)展為人們理解抗病性狀的遺傳調(diào)控機(jī)制及抗病基因分子標(biāo)記檢測提供了新的角度。而目前極少有研究探索豬疾病的表觀遺傳調(diào)控。因此,本研究采用全基因組轉(zhuǎn)錄組測序和甲基化測序相結(jié)合的策略,探究豬外周單核細(xì)胞(PBMCs)抗病毒免疫應(yīng)答過程中基因表達(dá)、DNA甲基化狀態(tài)變化以及DNA甲基化對免疫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,以期從表觀遺傳學(xué)角度揭示其抗病及免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)理,獲得增強(qiáng)免疫反應(yīng)相關(guān)的基因及DNA甲基化標(biāo)識,從而為豬的分子抗病育種提供新的依據(jù)。本研究以雙鏈RNA病毒模擬物Poly I:C作為免疫刺激劑,開展PBMCs體外抗病毒免疫反應(yīng)試驗(yàn)。通過檢測不同Poly I:C作用濃度和時(shí)間免疫相關(guān)基因(IL6、IL8、TNFα、IFNα、 IFNγ、IRF3、TLR3)的表達(dá)水平,確定最佳作用濃度和時(shí)間為20 ug/ml、24 h。以35日齡的大蒲蓮、長白仔豬各3頭為試驗(yàn)材料,分離其PBMCs。每個(gè)個(gè)體PBMCs均分為2份,處理組添加Poly I:C至終濃度為20 ug/ml,對照組添加PBS,同時(shí)培養(yǎng)24 h。比較分析Poly I:C刺激和對照PBMCs轉(zhuǎn)錄組及全基因組DNA甲基化差異。比較分析兩品種豬基因表達(dá)模式差異,獲得大蒲蓮豬特異性差異表達(dá)基因218個(gè)、長白豬特異性差異表達(dá)基因226個(gè)(FDR0.05),其中大蒲蓮豬有更多基因富集到免疫相關(guān)功能條目。與前期豬抗病毒免疫應(yīng)答研究結(jié)果比較,獲得7個(gè)(LAGS、DUSP1、MGPMS4A7、 DNM1、CYPIA1、HNF4A)可能影響豬抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)的候選基因。本研究構(gòu)建了豬PBMCs全基因組甲基化圖譜,并揭示了其DNA甲基化特征：CpG密度為51-55個(gè)CpGs/kb、CpGo/e比例約為0.6的序列具有更高的甲基化水平,染色體亞端粒區(qū)甲基化水平顯著高于非亞端粒區(qū),甲基化水平在TSS附近顯著下降、基因本體內(nèi)顯著升高,CpG島甲基化水平高于CpG岸。差異甲基化分析檢測出5,827差異甲基化區(qū)域(DMRs),涉及1,890個(gè)差異甲基化基因,其中68個(gè)基因差異甲基化且差異表達(dá)。Poly I:C刺激后,PACSIN1基因啟動子甲基化水平顯著升高,而nRNA表達(dá)顯著降低。啟動子甲基化功能研究表明,DNA甲基化可通過抑制啟動子轉(zhuǎn)錄活性而抑制PACSIN1基因的表達(dá)。RNAi試驗(yàn)顯示,PACSIN1基因沉默可促進(jìn)IL6、IL8、TNFα、NECAP2的表達(dá)。上述結(jié)果表明,DNA甲基化可通過降低啟動子的轉(zhuǎn)錄活性而抑制PACSIN1基因的表達(dá),該基因低表達(dá)促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的生成,進(jìn)而增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究建立了Poly I:C誘導(dǎo)豬PBMCs體外分析模型,揭示了抗病毒反應(yīng)過程中PBMCs基因表達(dá)和全基因組DNA甲基化水平變化以及DNA甲基化對免疫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控作用。本研究將加深人們對抗病毒反應(yīng)中表觀遺傳調(diào)控作用的認(rèn)識,獲得的豬PBMC DNA甲基化數(shù)據(jù)有望作為豬表觀基因組數(shù)據(jù)資源的一部分,用于豬表觀遺傳流行病學(xué)研究以及組織特異性甲基化模式分析研究中。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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