【摘要】：自然界中,病原卵菌能夠分泌RxLR類效應因子到寄主細胞中操控寄主體內的生理生化過程,從而有效生長和繁殖,導致寄主感病。葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola(Berk.and Curt.)Berl.and de Toni)是嚴格的活體營養(yǎng)專性寄生卵菌,其引起的葡萄霜霉病(downy mildew)是威脅全世界葡萄生產最嚴重的病害之一。本實驗室利用RNA-Seq的方法從葡萄霜霉菌菌株'ZJ-1-1'中分析得到了 31個候選RxLR效應因子,然而它們在侵染寄主過程中扮演的角色尚不清楚。因此,在本研究中,我們對這些候選RxLR效應因子進行特征及功能分析,并重點研究了兩個效應因子的功能及對病原菌毒性的貢獻,為葡萄-霜霉菌互作機制的研究奠定理論基礎。從葡萄霜霉菌菌株'ZJ-1-1'預測的31個RxLR效應因子中成功克隆了 23個,這些效應因子在不同侵染時期的表達模式主要分為四種類型。利用瞬時轉化本氏煙的方法,我們發(fā)現(xiàn)17個效應因子能夠完全抑制6種不同細胞死亡誘導蛋白(BAX、INF1、PsCRN63、PsojNIP、PvRxLR16和R3a/Avr3a)激發(fā)的程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)反應,表明被研究的這些效應因子大多數具有廣譜抑制PCD的功能。在本氏煙細胞中進行亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn),16個RxLR效應因子定位于細胞核和細胞質,6個效應因子特異性定位于細胞核,僅有一個定位于細胞膜,表明細胞核是RxLR效應因子在植物體內實現(xiàn)功能的重要部位之一。為了明確葡萄RxLR效應因子對植物先天免疫的影響,我們選擇了表達時間最早,表達量最高,并且能夠廣譜抑制PCD的PvRxLR28進行深入研究。瞬時表達實驗結果表明,蛋白的C端是其功能結構域,抑制PCD的功能依賴于細胞核定位。瞬時和穩(wěn)定表達研究結果顯示,PvRxLR28能夠顯著性提高葡萄和本氏煙對病原菌的感病性,同時還降低了轉基因植株中活性氧的含量和抗病相關基因的表達量。表明PvRxLR28可能是作為PCD廣譜抑制因子操控植物的免疫反應。PvRxLR16是唯一能夠激發(fā)本氏煙細胞死亡的效應因子,特異性定位于植物細胞核。我們對它的不同缺失突變體、點突變體和定位突變體進行功能分析,發(fā)現(xiàn)W/Y/L結構域、預測的糖基化位點Asn-240及核定位對于引起細胞死亡的功能是必需的。利用病毒介導的基因沉默(VIGS)方法驗證了PvRxLR16被本氏煙識別激發(fā)細胞壞死是通過ETI途徑中SGT1、Hsp90和RAR1介導的,而不依賴于PTI反應中的Serk3。運用同樣的方法,發(fā)現(xiàn)MAPK級聯(lián)反應中的激酶和轉錄因子也參與了 PvRxLR16被識別的信號通路。瞬時表達PvRxLR16還能夠激發(fā)本氏煙活性氧的積累和抗病相關基因的表達從而提高對辣椒疫霉菌的抗性。然而,PvRxLR16激發(fā)的這些防御反應又能被其他的PvRxLRs所抑制,表明在自然條件下它可能不會激發(fā)植物免疫反應。通過酵母雙雜交(Y2H)技術篩選出了 PvRxLR16在葡萄中的靶蛋白VaCUE,并利用雙分子熒光互補(BiFC)和免疫共沉淀技術(Co-IP)加以驗證。研究發(fā)現(xiàn),二者互作也依賴于PvRxLR16的W/Y/L結構域和三個預測糖基化位點。VaCUE表達受到葡萄霜霉菌的誘導,但是具體功能以及受PvRxLR16調控機制還需進一步研究。
【圖文】：

御信號轉導（Ｃｏｌｌｉｅｒ邋ａｎｄ邋Ｍｏｆｆｅｔｔ，邋２００９）。它們之間識別的分子機制一直是植物與病原菌互作的研究逡逑熱點。在過去的十幾年中，大量的研巧人員致力于探索病原菌基因是如何被植物基因識別逡逑的。研巧表明，病原菌與寄主之間的識別機制主要分為直接和間接兩種方式（圖１－２），而互作模逡逑式可Ｗ分為Ｗ下幾種；逡逑１．２．１經典受體－配體模式逡逑該模式認為，植物Ｒ蛋白（受體）與病原菌Ａｔ基因的編碼產物（配體）直接相互作用，觸逡逑發(fā)侵染位點細胞內的信號傳遞過程，從而激發(fā)寄主植物的防衛(wèi)反應產生抗病性（Ｇａｂｒｉｅｌ邋ａｎｄ邋Ｒｏ抵，逡逑１９９０）。這種直接識別模式在真菌與植物互作中發(fā)現(xiàn)較多，例如水稻抗病蛋白Ｐｉ拉的Ｎ端ＬＲＲ結逡逑構域能夠直接與稻遍菌Ａｖｒ－Ｐｉｔａ效應因子互作，激活下游信號傳導通路，從而誘導植物產生抗病逡逑反應。而該ＬＲＲ結構域中一個關鍵氨基酸的突變能夠影響二者識別作用導致寄主喪失抗病性（Ｊｉａ逡逑Ｗａ／．，２０００）。亞麻抗鎊病基因Ｌ５、Ｌ６和Ｌ７能與亞麻鑄菌無毒基因直接互作激活免疫反逡逑應（Ｄｏｄｄｓ邋ｗａ／．，２００６）。后期研巧發(fā)現(xiàn)，將ＡｖｒＬ５６７蛋白晶體結構表面的幾個氨基酸突變之后會破逡逑壞其與抗病蛋白的互作（Ｗａｎｇ幻ａ／．，２００７）。另外，亞麻抗病蛋白Ｍ同樣是Ｗ直接互作的方式與亞逡逑麻誘菌效應蛋白ＡｖｒＭ互作（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ邋Ｗ邋ａ／．

圖１－３葡萄霜霉病的危害及葡萄霜霉菌的形態(tài)特征（Ｇｃｓｓｌｅｒｗａ／．．２０Ｕ）逡逑Ｆｉｇｕ代邋１－３邋Ｄａｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｇ巧ｐｅｖｉｎｅ邋ｄｏｗｎｙ邋ｍｉｌｄｅｗ邋ａｎｄ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋Ｐ邋ＷｎＶｕ／ｕ逡逑（Ｇｅｓｓｋｒ邋ｅ？邋ｆｌ／．，２０Ｕ邋）逡逑霜霉菌形態(tài)特征及致病過程逡逑霉病的病原菌是葡萄單軸霜霉［／Ｖａｓｗｏｐｗｏ邋ｖｖＹ／＇ｃｏ／ｆｌ＾ｅｒｋ．邋＆邋Ｃｕｒｔ．）邋Ｂｅｒｌ．邋＆邋ｄｅ邋Ｔｏｎｉ］，卵菌綱，霜霉目，單軸霉屬（Ｇｅｓｓｌｅｒｅ／曰／．，２０１１）。該病原菌是二倍體活體營養(yǎng)型能夠在葡萄細胞間擴展蔓延，通過形成球狀吸器深入到植物細胞內吸取營養(yǎng)物質簇生，成束從葉片遠軸面的氣孔伸出，大小為４００－７８０邋ｎｍｘ６－ｎｎｍ，單軸近直角般為２－３次，分枝末端有２－３個圓錐形小梗，末端純，小梗上著生著抱子囊（董子囊無色，單胞，卵形或楠圓形，有乳狀突起。在條件適宜的情況下，抱子囊萌發(fā)抱子（王葉|!和李云，１９８８）。游動抱子腎臟形，扁平端側生兩根鞭毛，能在水中，抱子游動半個小時后鞭毛開始收縮直至變成圓形而停止活動（Ｋｉｅｆｅｒ邋ｅ／ａ／．，，２００２１５分鐘后圓形抱子開始萌發(fā)產生芽管，從葡萄葉片背面氣孔侵入體內。在侵染病原菌開始有性生殖，在其侵染發(fā)病部位形成卵抱子，卵抱子褐色、近球形、外起伏。其存活時間可長達數年，第二年春天溫度達到ｉｒｃ后，在一定濕度下卵
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S436.631

【參考文獻】

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本文編號：2543299