本文關(guān)鍵詞：化學(xué)雜交劑單嘧磺酯鈉誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育分子機(jī)制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：油菜雜種優(yōu)勢顯著,化學(xué)殺雄已成為油菜雜種優(yōu)勢利用的有效途徑之一。已有研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種磺酰脲類除草劑在低濃度時(shí)可以作為化學(xué)殺雄劑用于油菜雜交育種;但迄今關(guān)于化學(xué)雜交劑(Chemical Hybridization Agent,CHA)誘導(dǎo)植物雄性不育的機(jī)理卻知之甚少,這嚴(yán)重阻礙化學(xué)殺雄技術(shù)的應(yīng)用以及新的殺雄劑的開發(fā)。為揭示本課題組新近開發(fā)的CHA-單嘧磺酯鈉(Monosulfuron Ester Sodium,MES)誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育的分子機(jī)理,本研究首先觀察了對(duì)照可育組和CHA-MES誘導(dǎo)不育組花藥絨氈層細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化;然后利用油菜表達(dá)譜芯片技術(shù)分析了正常情況下油菜花藥發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的變化情況;同時(shí)對(duì)可育和不育花藥的差異轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,篩選出一系列不育相關(guān)候選基因;最后利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)在擬南芥植株上驗(yàn)證候選基因與植物育性之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.通過對(duì)正常可育和CHA-MES誘導(dǎo)不育花藥細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn):在花粉母細(xì)胞時(shí)期,可育花藥中多層細(xì)胞開始分化形成,絨氈層細(xì)胞和花粉母細(xì)胞保持著高度的分裂性;而MES誘導(dǎo)不育花藥中,花粉母細(xì)胞則出現(xiàn)異常的細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象。伴隨著發(fā)育的進(jìn)行,可育花藥進(jìn)入四分體時(shí)期,小孢子初級(jí)花粉外壁結(jié)構(gòu)開始形成,同時(shí)伴隨著絨氈層細(xì)胞向分泌型轉(zhuǎn)化,出現(xiàn)大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu);MES誘導(dǎo)不育花藥中,多數(shù)細(xì)胞無法正常進(jìn)行減數(shù)分裂,僅能觀察到彼此分離的嚴(yán)重質(zhì)壁分離的性母細(xì)胞。單核花粉粒時(shí)期,可育小孢子中形成一個(gè)大液泡以及豐富的細(xì)胞器結(jié)構(gòu),絨氈層細(xì)胞壁降解,細(xì)胞質(zhì)融合,出現(xiàn)兩種特殊的質(zhì)體結(jié)構(gòu)(造油體和絨氈層小體),向小孢子堆疊,進(jìn)一步加固花粉外壁結(jié)構(gòu);MES誘導(dǎo)不育花藥中,少量的細(xì)胞通過四分體時(shí)期進(jìn)入單核花粉粒時(shí)期,但花粉粒中幾乎無內(nèi)容物,有的無法形成完整的花粉外壁。而絨氈層細(xì)胞也出現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)異常,如細(xì)胞壁不降解,細(xì)胞質(zhì)無法融合;細(xì)胞質(zhì)融合但不降解;造油體和絨氈層小體結(jié)構(gòu)異常等等。成熟花粉粒時(shí)期,正�？捎亩嘶蛉嘶ǚ哿Ｖ锌梢娫S多顆粒狀的儲(chǔ)存物質(zhì)及豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu);而MES誘導(dǎo)不育花藥中,花粉徹底敗育,花粉粒空秕無內(nèi)容物,絨氈層細(xì)胞殘留物呈凝固塊狀,或?yàn)槿员Ａ艏?xì)胞壁的死細(xì)胞。此外,單核花粉粒時(shí)期的不育花藥外皮層和內(nèi)皮層中葉綠體結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)異常現(xiàn)象。因此,正常的油菜花藥發(fā)育過程涉及到多種細(xì)胞和細(xì)胞器的參與,而CHA-MES處理則導(dǎo)致花粉母細(xì)胞、絨氈層細(xì)胞、以及藥壁細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞,尤其體現(xiàn)在質(zhì)體結(jié)構(gòu)的異常方面。2.通過對(duì)油菜正�？捎仓耆~片及不同發(fā)育階段花藥的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):在油菜花藥發(fā)育過程中存在廣泛的基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化過程。通過對(duì)三個(gè)花藥組織與葉片的比較,以及花藥組織之間的兩兩比較,共篩選到11,678個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本(differentiallyexpressedtranscripts,dets)。從這些dets的分布來看,在花藥發(fā)育早期,dets數(shù)目較少,但其表達(dá)水平變化幅度較大,而后期,涉及到大量基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)整。使用kmeans聚類方法將11,678個(gè)dets根據(jù)其在四個(gè)組織中的表達(dá)變化情況分成15種不同的表達(dá)模式(dominantpatterns,dps),每個(gè)dp中包含89到4319個(gè)dets。其中,dp1-dp5包含705個(gè)轉(zhuǎn)錄本,表現(xiàn)為在花藥發(fā)育早期(sbs和an-mbs)時(shí)高表達(dá),而dp6-dp12中包含的1,517個(gè)轉(zhuǎn)錄本在晚期花藥(an-lbs)中高表達(dá)。對(duì)各dp中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行基因功能的go富集分析發(fā)現(xiàn),與內(nèi)膜系統(tǒng)相關(guān)的基因在花藥發(fā)育早期和晚期均有富集(dp1,dp5,dp6,dp8,dp9)。此外,在花藥發(fā)育早期(dp1-dp5),與花粉外壁形成和丙三醇代謝相關(guān)的基因被富集;而花藥發(fā)育晚期(dp6-dp12),大量與細(xì)胞壁或果膠代謝相關(guān)的基因被富集。15個(gè)dp中涉及到的脂肪酸以及碳水化合物代謝相關(guān)基因分布情況顯示,脂肪酸代謝相關(guān)基因主要在花藥發(fā)育早期富集,而碳水化合物代謝相關(guān)基因則在后期富集。3.對(duì)正�？捎蚦ha-mes誘導(dǎo)不育植株葉片及花藥組織進(jìn)行差異轉(zhuǎn)錄組分析:共篩選到1,501個(gè)受cha-mes影響的與油菜花藥發(fā)育相關(guān)的dets,其中64%的dets在不育株中下調(diào)表達(dá),36%上調(diào)表達(dá)。并且葉片(ls)和小花蕾(sbs)中檢測到的dets數(shù)目較少(分別為77和67個(gè));而中后期花蕾的花藥(an-mbs和an-lbs)中則檢測到相對(duì)較多的dets(161和1,238)。利用擬南芥同源基因?qū)σ陨蟙ets進(jìn)行了功能注釋。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)基因分布于質(zhì)體/葉綠體、線粒體和細(xì)胞核中�；蚬δ芊诸惡透患治霭l(fā)現(xiàn)cha-mes處理主要影響了花藥發(fā)育過程中與碳水化合物和脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。利用mapman軟件進(jìn)行的代謝途徑分析也證實(shí)了以上結(jié)果。結(jié)合基因功能富集和代謝途徑分析,篩選到了一系列與脂肪酸和碳水化合物代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因,推測其可能與mes誘導(dǎo)油菜雄性不育緊密相關(guān)。最后,可育和不育植株葉片和花蕾中糖類物質(zhì)含量的變化進(jìn)一步證實(shí)了cha-mes處理的確影響了葉片和花蕾中碳水化合物的代謝。4.雖然有報(bào)道稱磺酰脲類除草劑的作用靶標(biāo)是乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,als),但該類除草劑作為殺雄劑使用時(shí)的基本作用機(jī)理尚未見報(bào)道。本研究利用擬南芥抗磺酰脲類除草劑突變體cs204為材料,驗(yàn)證了cha-mes誘導(dǎo)植物雄性不育的作用靶標(biāo)同為als酶。同時(shí),利用trv病毒介導(dǎo)的基因沉默體系(trv-vigs)干擾擬南芥植株體內(nèi)的als基因表達(dá),也可以獲得雄性不育株,且隨著als基因表達(dá)量下降程度的增加,植株出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育障礙。這與化學(xué)殺雄劑對(duì)植物生長發(fā)育的影響是相似的,即低濃度下誘導(dǎo)雄性不育,高濃度下嚴(yán)重抑制生長。此外,通過差異轉(zhuǎn)錄組分析我們得到了一系列可能與花藥育性相關(guān)的基因,根據(jù)它們的表達(dá)情況及所涉及的功能,挑選了42個(gè)作為候選基因。利用TRV-VIGS技術(shù)在擬南芥中快速篩選與植物育性相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)了2個(gè)可能與植物育性相關(guān)的基因。綜上,本研究提出CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育的初步機(jī)理為:MES藥物處理首先抑制了花藥中ALS酶的活性,影響了植株花藥中與碳水化合物和脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá),導(dǎo)致油菜中精細(xì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重排,質(zhì)體及其他細(xì)胞器結(jié)構(gòu)異常,最終導(dǎo)致雄性不育。也許正是因?yàn)榛ㄋ幇l(fā)育對(duì)質(zhì)體以及碳水化合物和脂肪酸代謝過程的需求程度明顯高于其他組織,才造成油菜花藥組織對(duì)低濃度的MES高度敏感,而其他組織則不敏感。
【關(guān)鍵詞】：油菜 單嘧磺酯鈉 雄性不育 超微結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄組 脂肪酸代謝 碳水化合物代謝 TRV-VIGS
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S565.4
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-38
• 1.1 油菜的雜種優(yōu)勢及其利用16-19
• 1.1.1 植物雜種優(yōu)勢利用16-17
• 1.1.2 油菜雜種優(yōu)勢利用途徑17-19
• 1.2 植物化學(xué)雜交劑研究概況19-26
• 1.2.1 植物化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)雄性不育研究的發(fā)展歷史19-20
• 1.2.2 油菜化學(xué)雜交劑的的發(fā)展及使用現(xiàn)狀20-23
• 1.2.3 殺雄劑單嘧磺酯鈉的化學(xué)特性23-26
• 1.3 油菜雄性不育的發(fā)生機(jī)理26-31
• 1.3.1 高等植物花藥發(fā)育過程26-27
• 1.3.2 油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生機(jī)理27-28
• 1.3.3 油菜細(xì)胞核雄性不育的發(fā)生機(jī)理28
• 1.3.4 油菜化學(xué)殺雄劑誘導(dǎo)的雄性不育28-31
• 1.4 植物花藥轉(zhuǎn)錄組研究概況31-33
• 1.4.1 正�；ㄋ庌D(zhuǎn)錄組研究概況31-32
• 1.4.2 不育花藥與正常花藥的比較轉(zhuǎn)錄組研究32-33
• 1.5 病毒介導(dǎo)的植物基因沉默技術(shù)及其應(yīng)用33-37
• 1.5.1 VIGS技術(shù)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用34-35
• 1.5.2 煙草脆裂病毒介導(dǎo)的VIGS35-37
• 1.6 本研究的目的和意義37-38
• 第二章 CHA-MES對(duì)甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)影響38-51
• 引言38
• 2.1 材料、試劑及儀器38-39
• 2.1.1 材料38
• 2.1.2 試劑及儀器38-39
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法39
• 2.2.1 供試材料的種植39
• 2.2.2 單嘧磺酯鈉溶液的配制39
• 2.2.3 化學(xué)殺雄處理及樣品采集39
• 2.2.4 透射電鏡樣品制備及觀察39
• 2.3 結(jié)果與分析39-48
• 2.3.1 花粉母細(xì)胞時(shí)期對(duì)照組與處理組花藥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較40-41
• 2.3.2 四分體時(shí)期對(duì)照組與處理組花藥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較41-43
• 2.3.3 單核花粉粒時(shí)期對(duì)照組與處理組花藥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較43-45
• 2.3.4 成熟花粉粒時(shí)期對(duì)照組與處理組花藥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較45-47
• 2.3.5 單核花粉粒時(shí)期對(duì)照組與處理組花藥外皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較47-48
• 2.4 討論與結(jié)論48-51
• 第三章 甘藍(lán)型油菜花藥正常發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組分析51-73
• 引言51
• 3.1 材料、試劑及儀器51-52
• 3.1.1 植物材料51
• 3.1.2 試劑、儀器及軟件工具51-52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法52-54
• 3.2.1 供試植物材料的種植及樣品采集52
• 3.2.2 RNA提取、芯片雜交、數(shù)據(jù)采集以及歸一化處理52-53
• 3.2.3 基因表達(dá)的差異顯著性分析及功能注釋53
• 3.2.4 差異表達(dá)基因的聚類分析53
• 3.2.5 GO功能富集分析53-54
• 3.2.6 基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測54
• 3.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR分析54
• 3.3 結(jié)果與分析54-69
• 3.3.1 甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育過程中各階段轉(zhuǎn)錄組的檢測54-57
• 3.3.2 甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育過程中各階段轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化情況57-59
• 3.3.3 甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育中差異表達(dá)基因的注釋、聚類以及功能分析59-63
• 3.3.4 甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育中脂肪酸及碳水化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化63-67
• 3.3.5 甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育過程中的代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)分析67-68
• 3.3.6 Real-time PCR驗(yàn)證68-69
• 3.4 討論與結(jié)論69-73
• 3.4.1 植物花藥發(fā)育早期和晚期之間普遍存在著轉(zhuǎn)錄組的調(diào)整變化69-70
• 3.4.2 油菜花藥轉(zhuǎn)錄組功能從早期的脂肪酸代謝到晚期的碳水化合物代謝轉(zhuǎn)變70-71
• 3.4.3 油菜花藥發(fā)育過程中的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)71-73
• 第四章 CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜不育花藥的差異轉(zhuǎn)錄組分析73-93
• 引言73
• 4.1 材料、試劑及儀器73-74
• 4.1.1 材料73-74
• 4.1.2 試劑及儀器74
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法74-76
• 4.2.1 供試植物材料的種植、MES處理及樣品采集74-75
• 4.2.2 RNA提取、芯片雜交、數(shù)據(jù)采集以及歸一化處理75
• 4.2.3 利用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)75
• 4.2.4 差異基因的篩選及功能注釋75
• 4.2.5 差異基因的功能分類、富集分析以及代謝途徑分析75-76
• 4.2.6 碳水化合物含量測定76
• 4.3 結(jié)果與分析76-89
• 4.3.1 CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育的差異表達(dá)基因篩選76-79
• 4.3.2 CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的注釋及功能分析79-83
• 4.3.3 CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育株差異表達(dá)基因的代謝途經(jīng)分析83
• 4.3.4 碳水化合物和脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)量變化情況83-88
• 4.3.5 CHA-MES誘導(dǎo)油菜雄性不育植株葉片及花藥中碳水化合物含量的變化88-89
• 4.4 討論與結(jié)論89-93
• 4.4.1 CHA-MES可能通過影響質(zhì)體和線粒體的結(jié)構(gòu)而影響花藥的育性89
• 4.4.2 CHA-MES影響花藥發(fā)育過程中脂肪酸和碳水化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá)89-90
• 4.4.3 CHA-MES誘導(dǎo)植物雄性不育過程與ALS抑制劑除草過程的比較90-92
• 4.4.4 推測CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜發(fā)生雄性不育的工作模型92-93
• 第五章 CHA-MES誘導(dǎo)植物雄性不育靶標(biāo)的驗(yàn)證及不育候選基因的篩選93-105
• 引言93
• 5.1 材料、試劑及儀器93-94
• 5.1.1 材料93
• 5.1.2 試劑及儀器93-94
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法94-95
• 5.2.1 CHA-MES誘導(dǎo)擬南芥雄性不育的處理94
• 5.2.2 花粉活力顯微觀察94
• 5.2.3 TRV-VIGS載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌處理94-95
• 5.2.4 目標(biāo)基因的半定量檢測95
• 5.3 結(jié)果與分析95-103
• 5.3.1 ALS酶作為CHA-MES誘導(dǎo)植物雄性不育作用靶標(biāo)的驗(yàn)證95-96
• 5.3.2 TRV-VIGS載體構(gòu)建及干擾體系建立96-99
• 5.3.3 TRV介導(dǎo)的ALS基因沉默可誘導(dǎo)擬南芥植株發(fā)生雄性不育現(xiàn)象99-101
• 5.3.4 利用TRV-VIGS技術(shù)篩選其他與植物育性相關(guān)的候選基因101-103
• 5.4 討論與結(jié)論103-105
• 第六章 全文總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)105-107
• 6.1 全文總結(jié)105-106
• 6.1.1 CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育的超微結(jié)構(gòu)觀察105
• 6.1.2 甘藍(lán)型油菜花藥發(fā)育過程中物質(zhì)代謝相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)105
• 6.1.3 CHA-MES誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育花藥的差異轉(zhuǎn)錄組分析105-106
• 6.1.4 CHA-MES誘導(dǎo)植物雄性不育的靶標(biāo)驗(yàn)證以及不育候選基因的篩選106
• 6.2 全文結(jié)論106
• 6.3 創(chuàng)新點(diǎn)106-107
• 參考文獻(xiàn)107-118
• 附錄118-126
• 縮略詞126-127
• 致謝127-128
• 作者簡介128-129

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  本文關(guān)鍵詞：化學(xué)雜交劑單嘧磺酯鈉誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜雄性不育分子機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：254084