【摘要】：隨著人們生活水平的不斷改善,奶產品在整個國民經濟中所占的地位日益提高。為了提高產奶量,往往在奶牛飼糧中添加大量高精飼料,這樣做雖然在一定程度上提高了奶牛的產奶性能,但卻非常容易引發(fā)瘤胃亞急性酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)。作為一種常見的代謝疾病,SARA的發(fā)病率較高,在奶牛泌乳早期和中期高達20%以上,并且有逐年上升的趨勢,這給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經濟損失。當SARA發(fā)生時,瘤胃內的細菌脂多糖(lipopolysaccharid,LPS)濃度增加,刺激機體釋放大量的炎癥細胞因子,致使機體產生一系列的炎癥反應和代謝模式的變化,從而導致奶牛的產奶量和奶品質下降。因此,如何抑制LPS誘導的炎性細胞因子的產生,提高產奶量成為我們迫切需要解決的重要奶業(yè)科學問題。14-3-3蛋白家族是高度保守的二聚體蛋白,廣泛地存在于幾乎所有生物體細胞中,在哺乳動物中有7種亞型(β、γ、ε、δ、ε、ζ和η),在抑制細胞凋亡、介導細胞信號轉導、調控細胞周期等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明,14-3-3γ參與了許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程,并在一些病理過程中表達量升高。這些研究結果提示我們,14-3-3γ可能在提高機體對損傷的反應性以及抗損傷修復等方面非常重要。本項目前期研究結果顯示,奶牛乳腺上皮細胞中14-3-3γ過表達能夠有效促進乳蛋白和乳脂肪的合成,并能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細胞的活性。那么,14-3-3γ是否能通過抑制炎癥信號轉導通路和促進泌乳功能進而提高SARA奶牛的產奶量和奶品質就成為了我們研究的重點。本研究中,利用組織塊培養(yǎng)法成功地獲得了原代奶牛乳腺上皮細胞,并建立了體外細胞泌乳模型;通過檢測不同濃度LPS對奶牛乳腺上皮細胞的毒性作用,篩選出了最佳的LPS濃度用以復制細胞炎癥模型;用CASY-TT方法、LDH活性測定法、吖啶橙熒光染色法和流式細胞技術檢測了奶牛乳腺上皮細胞的活性、增殖能力和凋亡情況;利用脂質體轉染法使得14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細胞中進行超表達或基因沉默;應用實時熒光定量RT-PCR法及蛋白免疫印跡(Western blotting)技術檢測了泌乳相關基因的mRNA和蛋白表達變化;用Western blotting技術檢測了β-酪蛋白的表達變化和炎癥通路中相關基因的蛋白表達變化;用實時熒光定量RT-PCR法和ELISA法測定了炎性細胞因子m RNA表達和分泌情況;用甘油三酯試劑盒和乳糖檢測試劑盒檢測了奶牛乳腺上皮細胞中甘油三酯和乳糖的含量變化;用酶活性試劑盒檢測了脂肪酸合成酶活性變化。本實驗研究結果表明:1.LPS對奶牛乳腺上皮細胞具有一定的毒性作用CASY分析法、LDH活性測試法、吖啶橙熒光染色法及流式細胞技術的檢測結果表明,LPS可以降低奶牛乳腺上皮細胞的活性和增殖能力、誘導細胞凋亡,并且這種毒性作用具有一定的劑量-效應關系和時間-效應關系。2.LPS影響奶牛乳腺上皮細胞的泌乳功能和泌乳相關基因的表達①檢測奶牛乳腺上皮細胞分泌甘油三酯、乳糖及β-酪蛋白的結果表明,LPS能顯著降低奶牛乳腺上皮細胞的泌乳功能。當LPS濃度大于等于100ng/mL時,甘油三酯含量與對照組相比較顯著降低(P0.05);當LPS的濃度大于等于1 000ng/mL時,乳糖含量與對照組相比顯著降低(P0.05);當LPS濃度大于100ng/mL時,奶牛乳腺上皮細胞內?-酪蛋白的表達降低。②熒光定量RT-PCR檢測表明,LPS下調奶牛乳腺上皮細胞泌乳有關基因的mRNA表達。與對照組相比,1 000ng/mL LPS能顯著降低mTOR、STAT5、S6K1、AKT1、4EBP1、PPARγ、SREBP1、FABP3、ACC、FAS和GLUT1的mRNA表達量(P0.05或P0.01)。③Western blotting檢測表明,LPS下調奶牛乳腺上皮細胞泌乳有關基因的蛋白表達,與對照組相比,1 000ng/mL LPS能顯著抑制m TOR、p-m TOR、S6K1、p-S6K1、AKT1、p-AKT1、SREBP1、PPARγ和GLUT1的蛋白表達(P0.05)。3.LPS引起奶牛乳腺上皮細胞14-3-3γ表達升高,提示14-3-3γ可能參與LPS誘導的炎癥反應過程。4.14-3-3γ超表達抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞分泌炎性因子和下調炎癥相關信號通路①熒光定量RT-PCR和ELISA檢測表明,14-3-3γ超表達可以明顯抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β和i NOS的m RNA表達,并且顯著降低奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的含量,與LPS組相比差異顯著(P0.05)。②Western blotting檢測表明,14-3-3γ超表達抑制TLR4蛋白的表達,下調NF-κB和MAPK信號通路。14-3-3γ超表達抑制IκB-α、ERK1/2和p38的磷酸化以及NF-κB的核轉位,與LPS組相比差異顯著(P0.05)。5.14-3-3γ對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞活性及其泌乳的影響①CASY分析法、流式細胞技術等檢測結果表明,與LPS對照組相比,14-3-3γ超表達促進LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的活性和增殖能力,抑制細胞凋亡;與LPS對照組相比,14-3-3γ基因沉默抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞活性和增殖能力,促進細胞凋亡,提示14-3-3γ對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的損傷有保護作用。②檢測細胞分泌甘油三酯、乳糖和β-酪蛋白結果表明,與LPS對照組相比,14-3-3γ超表達能促進LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞乳脂、乳糖和乳蛋白的合成和分泌;與LPS對照組相比,14-3-3γ基因沉默抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞乳脂、乳糖和乳蛋白的合成和分泌。③熒光定量RT-PCR及Western blotting檢測表明,與LPS對照組相比,14-3-3γ超表達增加mTOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和GLUT1的mRNA和蛋白表達量;與LPS對照組相比,14-3-3γ基因沉默減少m TOR、S6K1、AKT1、PPARγ、SREBP1和GLUT1的m RNA和蛋白表達量。綜上,14-3-3γ在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應中發(fā)揮重要的抗損傷保護作用。14-3-3γ可以通過降低NF-κB和MAPK信號通路的活性而抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和i NOS的分泌,減輕奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應,并且14-3-3γ能增加泌乳相關基因的表達,從而促進LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞的活性、增殖能力和乳成分的合成、分泌。本研究為有效控制LPS引起的奶牛泌乳能力下降和提高乳品質提供了新的實驗依據和理論參考。
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【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23

【參考文獻】

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本文編號：2463881