【摘要】：荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我國(guó)南方重要的亞熱帶果樹(shù),種質(zhì)資源豐富,果實(shí)色澤類型多樣,但荔枝果實(shí)色澤生物合成的機(jī)理尚不清楚。荔枝果實(shí)的著色是花色素苷積累的結(jié)果,模式植物中的研究發(fā)現(xiàn)花色素苷的生物合成調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平,MYB-b HLH-WD40蛋白復(fù)合體調(diào)控著花色素苷生物合成途徑。本文基于轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了可能參與荔枝花色素苷生物合成調(diào)控的MYB和b HLH轉(zhuǎn)錄因子,探討了MYB和b HLH轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控花色素苷生物合成途徑,研究結(jié)果為揭示荔枝果皮花色素苷生物合成和調(diào)控的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究了Lc MYB1轉(zhuǎn)錄因子的功能,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)Lc MYB1的煙草葉片和花梗積累花色素苷,而野生型煙草葉片和花梗不積累花色素苷。轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣中花色素苷含量的是野生型的3-4倍。煙草內(nèi)源的b HLH轉(zhuǎn)錄因子Nt An1a和Nt An1b的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因煙草葉片和花梗中明顯上調(diào)表達(dá),這可能是葉片和花梗能合成花色素苷的重要原因。另外,煙草葉片中的Nt DFR、Nt ANS和Nt UFGT基因也顯著上調(diào)表達(dá),這些基因可能是Lc MYB1轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。2、對(duì)荔枝果皮樣品進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序,一共得到了4.6 G的原始數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)組裝得到了51,089條Unigenes,這些Unigenes的平均長(zhǎng)度為737 bp。大約70%(34,705)的基因序列可以通過(guò)比對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋。此外,還對(duì)綠、黃和紅果皮階段的樣品分別進(jìn)行了數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序。分析發(fā)現(xiàn)3,649個(gè)基因在發(fā)育過(guò)程中顯著差異表達(dá),其中156個(gè)基因在三個(gè)階段中均顯著差異表達(dá)。在荔枝果皮轉(zhuǎn)錄組中鑒定到了葉綠素降解和類黃酮合成的關(guān)鍵基因,其中SGR基因在荔枝果皮葉綠素降解過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。大多數(shù)花色素苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都隨著果皮發(fā)育上升。通過(guò)比對(duì)鑒定發(fā)現(xiàn)了荔枝果皮中有53個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子,預(yù)測(cè)了10個(gè)可能參與荔枝果皮類黃酮生物合成調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子。3、在荔枝果皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中,發(fā)現(xiàn)了三個(gè)可能參與花色素苷生物合成調(diào)控的b HLH轉(zhuǎn)錄因子Lcb HLH1、Lcb HLH2和Lcb HLH3。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)三個(gè)b HLH轉(zhuǎn)錄因子與其它植物中調(diào)控花色素生物合成的b HLH轉(zhuǎn)錄因子聚在一起。Lcb HLH3只定位于細(xì)胞核,Lcb HLH2定位于細(xì)胞質(zhì),Lcb HLH1則定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。Lcb HLH1和Lcb HLH3都能在細(xì)胞核中與Lc MYB1相互作用。盡管三個(gè)b HLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與荔枝各個(gè)組織中的花色素苷含量無(wú)相關(guān)性,但Lcb HLH1或Lcb HLH3與Lc MYB1同時(shí)在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)均比單獨(dú)瞬時(shí)表達(dá)Lc MYB1積累更多的花色素苷,特別是Lcb HLH3。過(guò)表達(dá)Lc MYB1的煙草與過(guò)表達(dá)Lcb HLH3的煙草雜交后得到了同時(shí)超表達(dá)兩個(gè)基因的煙草株系,該煙草株系葉片能積累大量的花色素苷,而單獨(dú)過(guò)表達(dá)Lc MYB1的煙草葉片只能積累少量花色素苷,單獨(dú)過(guò)表達(dá)Lcb HLH3時(shí)煙草葉片則不能積累花色素苷。共表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中內(nèi)源的b HLH轉(zhuǎn)錄因子Nt AN1a和Nt AN1b的表達(dá)顯著上調(diào),結(jié)構(gòu)基因Nt DFR和Nt ANS也顯著上調(diào)表達(dá)。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明,與單獨(dú)表達(dá)Lc MYB1相比,Lc MYB1-Lcb HLH1或者Lc MYB1-Lcb HLH3同時(shí)表達(dá)能強(qiáng)烈激活Lc ANS的啟動(dòng)子活力,對(duì)Lc DFR啟動(dòng)子活性也有一定的促進(jìn)作用。綜上所述,Lcb HLH1和Lcb HLH3是Lc MYB1必要的相互作用因子,它們相互作用形成復(fù)合體調(diào)節(jié)花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因DFR和ANS的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)花色素苷的生物合成。4、在荔枝轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能與花色素苷生物合成調(diào)控相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子Lc MYB5和Lc MYB2。Lc MYB5在荔枝各個(gè)組織中均有表達(dá)且在荔枝果皮發(fā)育過(guò)程中表達(dá)變化不大。過(guò)表達(dá)Lc MYB5煙草花瓣和子房中的花色素苷含量顯著高于野生型,同時(shí)內(nèi)源的結(jié)構(gòu)基因Nt CHI、Nt F3H、Nt DFR和b HLH調(diào)控基因Nt AN1a和Nt AN1b表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)Lc MYB5煙草的花瓣、花絲、花藥和子房積累了大量的花色素苷,其中花瓣中花色素苷的含量是野生型花瓣4-5倍。Lc MYB5定位于細(xì)胞核,能與花色素苷生物合成調(diào)控的Lcb HLH1轉(zhuǎn)錄因子相互作用。雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明Lc MYB5可以激活花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因F3H和DFR的啟動(dòng)子,推測(cè)Lc MYB5與Lcb HLH1轉(zhuǎn)錄因子互作,通過(guò)調(diào)控花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的活力調(diào)控花色素苷的生物合成。Lc MYB5不僅參與了花色素苷的生物合成途徑,還參與了其它的一些生物過(guò)程,如轉(zhuǎn)Lc MYB5的煙草花瓣及葉片的p H值降低,花瓣變大。5、Lc MYB2與Vv MYB5亞族聚在一起,它在荔枝的各個(gè)組織中均有表達(dá),在荔枝果皮發(fā)育的早期表達(dá)量高。Lc MYB2在果皮發(fā)育中的表達(dá)模式與原花青素生物合成的關(guān)鍵基因Lc LAR和Lc ANR的表達(dá)一致。Lc MYB2定位于細(xì)胞核,能與Lcb HLH3相互作用。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示Lc MYB2與Lcb HLH3相互作用能激活原花青素生物合成基因Lc LAR和Lc ANR的啟動(dòng)子。推測(cè)Lc MYB2參與調(diào)控荔枝果皮中原花青素生物合成。轉(zhuǎn)Lc MYB2煙草花藥合成了少量花色素苷,說(shuō)明Lc MYB2在某些特殊組織也參與了花色素苷的生物合成。此外,轉(zhuǎn)Lc MYB2煙草的花藥和花藥中花粉的發(fā)育受到影響。
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【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S667.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 王惠聰,黃旭明,胡桂兵,黃輝白;荔枝果皮花青苷合成與相關(guān)酶的關(guān)系研究[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2004年12期

2 王惠聰,黃旭明,黃輝白;‘妃子笑’荔枝果實(shí)著色不良原因的研究[J];園藝學(xué)報(bào);2002年05期

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本文編號(hào)：2453113