【摘要】：植物先天免疫在感受到來自病原微生物的分子后激活,這些分子包括保守的病原物或微生物相關(guān)分子模式(PAMPs/MAMPs)以及多樣化的效應(yīng)分子(effectors)。病原物相關(guān)分子模式PAMPs觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI )和效應(yīng)分子effectors誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)(ETI)是植物抵抗病原物侵染的兩種有效武器,構(gòu)成了植物的天然免疫系統(tǒng)。毒性病原菌可以分泌大量效應(yīng)分子,這些效應(yīng)蛋白可以在植物的胞外起作用,也可以轉(zhuǎn)運到植物細胞并且在胞內(nèi)起作用。效應(yīng)分子的主要功能是抑制寄主免疫反應(yīng)從而促進生長和繁殖,達到成功侵染的目的。但是絕大部分效應(yīng)蛋白的生化功能和分子機制并不清楚。因此研究這些效應(yīng)蛋白在致病過程中的功能和分子機制,將有助于我們深入理解病原菌致病機理和植物免疫機制。疫霉屬病原菌能在植物上引起多種典型的植物病害,比如致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的馬鈴薯晚疫病和大豆疫霉(Phytophthora sojae)導(dǎo)致的大豆根腐病每年都給世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來毀滅性的危害。大豆疫霉隸屬于卵菌,這類病原菌雖然在形態(tài)上同真菌相似,但在進化上卻和硅藻及藍藻關(guān)系較近,所以現(xiàn)階段針對于真菌設(shè)計的殺菌劑往往對大豆疫霉和其它卵菌無效。在卵菌的胞內(nèi)效應(yīng)分子中,RxLR(R代表精氨酸,L代表亮氨酸,X代表任意氨基酸)和CRN ( Crinkler)效應(yīng)分子是最重要的兩類。這兩類效應(yīng)分子是模塊化的蛋白質(zhì):它們的N端含有保守的結(jié)構(gòu)域(RxLR和dEER或LFLAK )并且能幫助效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運到宿主細胞,而C端是多樣化的功能域,在細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)植物免疫反應(yīng)。由于與已知蛋白缺乏序列相似性,因此很難預(yù)測這些效應(yīng)蛋白的功能和作用機制。本文對大豆疫霉中的一個胞內(nèi)效應(yīng)子PsCRN63的功能進行了分析,并探究了其可能的毒性機制,獲得的主要結(jié)果與結(jié)論如下:大豆疫霉效應(yīng)分子PsCRN63與植物過氧化氫酶互作調(diào)控細胞死亡。先前的研究結(jié)果證明,大豆疫霉的效應(yīng)分子PsCRN63 (起皺和壞死誘導(dǎo)蛋白)能夠在植物中引起程序性細胞死亡(PCD, programmed cell death ),而PsCRN115可以阻斷這一過程;然而兩者對于病原菌的致病性都是必須的。這里,我們發(fā)現(xiàn)PsCRN63單獨表達或者PsCRN63和PsCRN115共同表達都能夠抑制煙草上的免疫反應(yīng);同時這兩個胞內(nèi)的效應(yīng)分子都可以與來自煙草(Nicotiana enthamiana)和大豆(Glycine max)中的過氧化氫酶互作。進一步,我們發(fā)現(xiàn)當在植物中表達PsCRN63時,煙草中的過氧化氫酶NbCAT1 (N.benthamiana CATALASE1 )和大豆中的過氧化氫酶GmCAT1的蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定,而PsCRN115可以阻止這一變化。實驗證明在煙草中瞬時表達PsCRN63可以導(dǎo)致過氧化氫(H2O2)的積累,PsCRN115則依然相反。最后,我們發(fā)現(xiàn)煙草中瞬時表達NbCAT1或者GmCAT1時可以特異性地緩解PsCRN63誘導(dǎo)的細胞死亡癥狀。因此,我們推測PsCRN63/115通過與過氧化氫酶互作干擾細胞內(nèi)過氧化氫的內(nèi)穩(wěn)態(tài),從而調(diào)控在植物上引起的細胞死亡。以上結(jié)果表明,大豆疫霉能夠分泌兩個效應(yīng)分子,通過與過氧化氫酶的直接互作,來調(diào)控細胞死亡和過氧化氫的內(nèi)穩(wěn)態(tài),進而克服寄主植物的免疫反應(yīng)。大豆疫霉效應(yīng)分子PsCRN63通過胞內(nèi)二聚化調(diào)控植物先天免疫。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),大豆疫霉的效應(yīng)分子PsCRN63能夠抑制病原物相關(guān)分子模式(PAMP)觸發(fā)的免疫(PTI)的標記基因,flg22誘導(dǎo)的FRK1基因的表達。但是,PsCRN63不能抑制PTI上游信號通路的相關(guān)事件,包括flg22誘導(dǎo)的MAPK的激活以及BIK1的磷酸化,這表明它作用于MAPK級聯(lián)反應(yīng)的下游。PsCRN63轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對病原細菌丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pathovar tomato, Pst)DC3000和病原卵菌辣椒疫霉(Phytophthoca capsici)的敏感性增強。另外,與野生型植株相比,PsCRN63轉(zhuǎn)基因植株中flg22誘導(dǎo)的活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)沉積均受到抑制。同時,PTI途徑相關(guān)基因的表達在PsCRN63轉(zhuǎn)基因植株中也受到下調(diào)。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)PsCRN63蛋白的N端和C端能夠通過反向連接的方式在植物細胞內(nèi)發(fā)生互作,從而形成一個同源二聚體。另外,形成二聚體所需的N端和C端結(jié)構(gòu)域在CRN效應(yīng)分子中非常保守,這暗示著疫霉CRN效應(yīng)分子的同源/異源聚合物的形成為其發(fā)揮生物學(xué)功能所必需。事實證明,二聚體的形成確為PsCRN63行使PTI抑制及細胞死亡誘導(dǎo)功能所必需。以上的研究結(jié)果能夠增進我們對卵菌效應(yīng)分子如何操縱植物免疫從而促進侵染的認識。
[Abstract]:The innate immunity of a plant is activated after a molecule from a pathogenic microorganism, which comprises a conserved pathogen or a microorganism-related molecular pattern (PMPs/ MMPs) and a variety of effector molecules. The immune response (PTI) and effector-induced immune response (ETI)-induced immune response (ETI), which are triggered by PMPs and effector-related molecular patterns, are two effective weapons for the plant to resist the infection of the pathogen, and constitute the natural immune system of the plant. The toxic pathogenic bacteria can secrete a large amount of effector molecules that can act outside the cell of the plant and can also be transported to the plant cells and function in the cell. The main function of the effector molecule is to inhibit the host immune response, thereby promoting growth and reproduction, and achieving the purpose of successful infection. However, the biochemical and molecular mechanisms of most effector proteins are not clear. Therefore, the study of the function and molecular mechanism of these effect proteins in the pathogenic process will help us to understand the pathogenic mechanism of the pathogenic bacteria and the mechanism of the plant immune. Phytophthora infestans can cause a variety of typical plant diseases on plants, such as Phytophthora infestans and Phytophthora sojae. Phytophthora sojae is a part of oomycetes, which is similar to the fungi in the form, but it has a close relationship with the diatom and the blue-green algae in the evolution, so the germicide designed for the fungus at the present stage is often ineffective for the Phytophthora sojae and other oomycetes. RxLR (R represents arginine, L represents leucine, X represents any amino acid) and CRN (Crinkler) effector molecules are the most important classes in the intracellular effector molecule of the oomycetes. These two types of effector molecules are modular proteins: their N-terminal contains a conserved domain (RxLR and dEOR or LFLAK) and can aid in the transport of effector proteins to the host cell, while the C-terminal is a diverse functional domain that is involved in the regulation of the plant immune response. Because of the lack of sequence similarity to known proteins, it is difficult to predict the function and the mechanism of action of these effector proteins. In this paper, the function of one intracellular effector PsCRN63 in Phytophthora sojae atricolor was analyzed and its possible toxicity mechanism was explored. The main results and conclusions were as follows: Previous studies have shown that the effects of Phytophthora sojae, PsCRN63 (creping and necrosis-inducing proteins), can cause programmed cell death in plants, while the PsCRN115 can block the process; however, both are essential to the pathogenicity of the pathogenic bacteria. Here, we found that the individual expression of the PsCRN63 or the co-expression of the PsCRN63 and the PsCRN115 can inhibit the immune response on the tobacco, and both intracellular effector molecules can interact with the catalase from the tobacco (Nicotiana enthamiana) and the soybean (Glycine max). Further, we have found that when the PsCRN63 is expressed in a plant, the protein of the catalase GmCAT1 (N. benthamiana CATAIL1) in the tobacco and the catalase GmCAT1 in the soybean becomes unstable, and the PsCRN115 can prevent this change. The experimental results show that the instantaneous expression of PsCRN63 in tobacco can lead to the accumulation of hydrogen peroxide (H2O2), and the PsCRN115 is still the opposite. Finally, we find that the transient expression of NbCAT1 or GmCAT1 in tobacco can specifically alleviate the cell death symptoms induced by PsCRN63. Therefore, we assume that PsCRN63/115 regulates the intracellular state of hydrogen peroxide within the cell by interacting with the catalase, thereby regulating the cell death induced on the plant. The results showed that Phytophthora sojae was able to secrete two effector molecules, and through direct interaction with catalase, the cell death and the internal steady state of hydrogen peroxide were regulated, and the immune response of host plants was overcome. Phytophthora sojae effect molecule PsCRN63 regulates the innate immunity of plants by intracellular dimerization. In this study, we found that the effect molecule PsCRN63 of Phytophthora sojae was able to inhibit the expression of the marker gene of the immune (PTI) triggered by the pathogen-related molecular pattern (PAMP), and the expression of the flg22-induced FRK1 gene. However, the PsCRN63 does not inhibit the related events of the signaling pathway upstream of the PTI, including the activation of the flg22-induced MAPK and the phosphorylation of BIK1, which indicates that it acts downstream of the MAPK cascade. The sensitivity of PsCRN63 transgenic Arabidopsis plants to the pathogenic bacteria of Pseudomonas syringae patovar tomas, Pst and Phytophthora capsici was enhanced. In addition, the active oxygen burst induced by flg22 in the PsCRN63 transgenic plant was inhibited compared to the wild-type plant. At the same time, the expression of PTI-related genes was also down-regulated in the transgenic plants of PsCRN63. Interestingly, we found that the N-and C-ends of the PsCRN63 protein were able to interact within the plant cells in a reverse-linked manner to form a homodimer. In addition, the N-and C-terminal domains required to form the dimer are very conserved in the CRN effector molecule, suggesting that the formation of the homologous/ heterologous polymer of the Phytophthora CRN effector molecule is necessary for its biological function. The formation of dimers has proven to be necessary for PsCRN63 to exercise PTI inhibition and cell death induction. The above results can improve our understanding of how to manipulate the plant to promote the infection.
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S432.4

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本文編號：2452598