本文關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組文庫的構(gòu)建和抗菌相關(guān)機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《寧夏大學(xué)》 2016年

解淀粉芽孢桿菌胞苷代謝途徑分析與高效基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建的研究

吳慶  

【摘要】：胞苷,即胞嘧啶核苷,可用作功能性食品及核營酸類保健食品的生產(chǎn)原料,也用于合成抗病毒和抗腫瘤藥物的中間體及飼料添加劑,用途廣泛,需求量逐年增加。微生物發(fā)酵法是工業(yè)生產(chǎn)胞苷的主要方法,高產(chǎn)菌株是其關(guān)鍵因素,已有枯草芽孢桿菌、大腸桿菌與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)胞苷的研究報道。但目前國內(nèi)胞苷高產(chǎn)菌株的發(fā)酵能力有限,受到多種因素的影響,而菌株細胞自身合成代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化是提高胞苷發(fā)酵產(chǎn)量必須要解決的問題。同時,為使解淀粉芽孢桿菌胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)修飾更加快速高效,需建立方便易操作的基因敲除系統(tǒng)。論文主要從以下兩個方面進行了研究。1、解淀粉芽孢桿菌胞苷合成代謝途徑分析。(1)胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)整體分析�；卩奏ど锖铣纱x調(diào)控和胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)分析,提出了5種解淀粉芽孢桿菌胞苷生產(chǎn)菌育種策略,即提高嘧啶操縱子轉(zhuǎn)錄水平,強化胞苷合成代謝途徑、增大磷酸戊糖途徑向胞苷合成途徑的分流量、提高胞苷合成前端代謝物PRPP的合成量、增強中心碳代謝流向胞苷合成途徑和阻斷胞苷降解途徑等方法,選育胞苷高產(chǎn)菌株。(2)嘧啶操縱子在胞苷合成中的作用分析。確定首先改造解淀粉芽孢桿菌嘧啶操縱子調(diào)控區(qū)域,研究其對胞苷合成的影響。操縱子調(diào)控區(qū)存在一個弱化調(diào)節(jié)蛋白PyrR,由pyrR基因編碼。該調(diào)節(jié)蛋白通過作用于pyr操縱子非翻譯區(qū)域的三段轉(zhuǎn)錄終止位點控制胞苷合成基因的表達與調(diào)控,但胞苷的過量合成與pyrR基因缺失影響尚不清楚。因此,可通過基因敲除技術(shù),定向選育pyrR基因缺失菌株,研究其對解淀粉芽孢桿菌胞苷生物合成途徑的調(diào)控機制。2、解淀粉芽孢桿菌高效基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建。為實現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌胞苷代謝網(wǎng)絡(luò)的修飾改造,建立高效的基因敲除系統(tǒng)顯得尤為重要。本研究構(gòu)建了兩個基因敲除載體系統(tǒng),并對其敲除效率做了比較分析。(1)自殺型敲除載體pKS1-pyrR的構(gòu)建。以解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,設(shè)計并合成含有限制性內(nèi)切酶酶切位點的引物,利用PCR分別擴增pyrR基因的上、游同源序列,定向克隆至含卡那霉素抗性基因的溫敏型載體pKS1上,構(gòu)建自殺型敲除載體pKS1-pyrR,酶切、PCR驗證與測序分析均證明pKS1-pyrR載體構(gòu)建正確。將pKS1-pyrR載體轉(zhuǎn)化宿主細胞,通過同源重組將靶基因替換。結(jié)果表明,該方法重組敲除效率較低、且有抗性基因片段殘留,增加菌體負擔。(2) CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建。首先構(gòu)建基因敲除載體系統(tǒng)pHT01-Cas9-donor。在解淀粉芽孢桿菌pyrR基因的45f和181r區(qū)通過PAM定位選擇合適的靶位點并合成sg RNA。改造pHT01質(zhì)粒改造,構(gòu)建質(zhì)粒pHT01-Cas9。通過酶切酶連操作依次將RBS序列、RepA序列、p43啟動子序列、sg RNA序列(45f/181r)和pyrR基因左右同源臂合并序列克隆至pHT01-Cas9載體中,酶切、PCR驗證與測序分析均證明pHT01-Cas9-donor載體構(gòu)建正確。(3)Cas9蛋白表達與pyrR基因誘導(dǎo)敲除。提取質(zhì)粒pHT01-Cas9-donor,轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌,菌落PCR及酶切驗證均表明pHT01-Cas9-donor載體已成功轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌。同時利用IPTG成功誘導(dǎo)Cas9蛋白表達。優(yōu)化Cas蛋白表達條件,得出Cas9蛋白最優(yōu)誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度30℃,IPTG濃度為0.6 mmol/L,誘導(dǎo)時間為6h。結(jié)果表明,pHT01-Cas9-donor敲除系統(tǒng)中各元件均能在解淀粉芽孢桿菌中很好的工作。但在最優(yōu)誘導(dǎo)條件下,嘗試敲除pyrR基因,均未成功,分析原因可能是設(shè)計的靶點基因sg RNA未表現(xiàn)活性。(4)兩種敲除系統(tǒng)的應(yīng)用與比較分析。自殺型敲除載體系統(tǒng)和CRISPR-Cas9系統(tǒng)都可以對目標基因組進行定點編輯。自殺型敲除載體系統(tǒng)是傳統(tǒng)經(jīng)典方法,至今仍被廣泛應(yīng)用,但是對于解淀粉芽孢桿菌來說,其轉(zhuǎn)化效率與重組效率較低,且很難將重組到基因組上的抗性基因再替換下來,會給將來工程菌株的生產(chǎn)應(yīng)用帶來麻煩,因此,需要進一步改進該敲除系統(tǒng)或找到另一種更好的替代方法。而CRISPR-Cas9敲除系統(tǒng)具有可供選擇位點多、可同時編輯多個位點和識別域,載體構(gòu)建更簡單的特點,且屬于無痕敲除,應(yīng)用前景好。本研究中構(gòu)建得到可在解淀粉芽孢桿菌中表達Cas9的敲除系統(tǒng),說明該系統(tǒng)可以很好的發(fā)揮功能,但由于只設(shè)計了2個靶點基因,數(shù)量較少,結(jié)果表明sg RNA無活性,故需要進一步設(shè)計較多數(shù)量的sg RNA,來提高敲除的效率。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3
【目錄】：

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