發(fā)布時間：2019-02-23 14:29

【摘要】：鴨蛋作為重要的營養(yǎng)來源,蛋黃中的n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFAs)和膽固醇含量對其品質(zhì)有重要影響。目前通過改變?nèi)占Z脂肪酸成分來改善蛋黃n-3 PUFAs及膽固醇含量的研究較多,然而其調(diào)控作用機(jī)制十分復(fù)雜,迄今為止尚未完全闡明。此外,綜合研究蛋品質(zhì)、腸道微生物以及脂類代謝的分子調(diào)控過程的文獻(xiàn)鮮有報道。本試驗以山麻鴨為研究對象,研究了不同油源(牛油T、菜籽油R、亞麻籽油FL和魚油F)對蛋品質(zhì)、蛋黃脂肪酸和膽固醇含量的影響,并通過數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(Digital Gene Expression,DGE)、實時定量 PCR(q-RT-PCR)技術(shù)、鴨肝原代細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)等方法研究山麻鴨脂肪酸和膽固醇代謝的調(diào)控通路,挖掘多不飽和脂肪酸和膽固醇代謝相關(guān)候選基因,初步闡明了日糧多不飽和脂肪酸降低蛋黃膽固醇并增加n-3 PUFAs的分子機(jī)制。同時,為綜合研究日糧油脂對山麻鴨的影響,本文分析了對照組和2%魚油組山麻鴨腸道形態(tài)及腸道微生物區(qū)系的差異。1.不同油源對山麻鴨蛋品質(zhì)、蛋黃脂肪酸和膽固醇含量的影響將585只370日齡產(chǎn)蛋性能良好的山麻鴨分為對照組(C)、牛油組(T)、菜籽油組(R)、亞麻籽油組(FL)和魚油組(F),每種油源設(shè)3個濃度梯度,分別為0.5%、1%和2%,飼喂后第28天檢測蛋品質(zhì)、蛋黃脂肪酸及膽固醇含量。結(jié)果顯示,4種油源的任意添加水平均對山麻鴨蛋品質(zhì)的影響不顯著。魚油、亞麻籽油和菜籽油能降低(P0.001)蛋黃總膽固醇(TC)、飽和脂肪酸(SFAs)和單不飽和脂肪酸(MUFAs)含量,而顯著增加多不飽和脂肪酸(PUFAs)、n-6多不飽和脂肪酸(n-6 PUFAs)、n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)含量。并且,魚油、亞麻籽油和菜籽油提高蛋黃EPA和DHA的作用具有劑量效應(yīng)。這表明富含不飽和脂肪酸的日糧能夠在保證蛋品質(zhì)不受影響的情況下,增加山麻鴨蛋黃n-3 PUFAs含量并降低蛋黃膽固醇含量。2.日糧魚油和亞麻籽油調(diào)控山麻鴨肝脂代謝的轉(zhuǎn)錄組分析在油脂添加試驗第28天采集對照組、2%魚油組和2%亞麻籽油組山麻鴨肝臟組織,提取肝臟總mRNA,反轉(zhuǎn)錄,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,以轉(zhuǎn)錄組從頭組裝(RNA-Seq denovo)結(jié)果為參考基因組進(jìn)行肝臟DGE分析。首先,全部9個樣本做混池(pool)處理,進(jìn)行RNA-Seq de novo,該過程共檢測到53.2 M clean reads,注釋獲得55,426個Unigenes。其中27,376個與公共數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列有同源性。然后,三個組共構(gòu)建9個DGE(數(shù)字基因表達(dá)譜,Digital Gene Expression)數(shù)據(jù)庫,平均每個DGE產(chǎn)生10 M clean reads,其中88-92.5%可注釋到RNA-Seq de novo結(jié)果中。與C相比,分別在FL和F組檢測到896和883個DEGs(差異表達(dá)基因,Different Expressed Genes),其中分別有36和25個與脂類代謝通路相關(guān)。與對照組相比,亞麻籽油顯著降低花生四烯酸(ARA)代謝相關(guān)基因(PTGS1、CYP2U)、膽固醇代謝相關(guān)基因(CYP3A、CYP2J、CYP2C)、初級膽汁酸合成相關(guān)基因(CYP8B1↓、CYP7A1↑)和其他脂肪酸合成相關(guān)基因(FASN、ACSL、SCD),魚油顯著降低CYP8B1、ACSL和FASN基因表達(dá),顯著促進(jìn)亞油酸代謝相關(guān)基因(CYP2C和CYP2J)的表達(dá),同時顯著降低與長鏈多不飽和脂肪酸合成相關(guān)的ELOVL2和FADS2基因的表達(dá),這表明魚油和亞麻籽油調(diào)節(jié)山麻鴨脂類代謝的機(jī)制有所不同。此研究豐富了山麻鴨遺傳信息,并為魚油和亞麻籽油降低動物產(chǎn)品膽固醇和增加n-3 PUFAs的研究提供了分子調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)。3.18 C脂肪酸對鴨肝細(xì)胞n-3 LCPUFAs合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響本研究通過兩步膠原酶灌流法分離山麻鴨雛鴨肝臟細(xì)胞,并采用常規(guī)肝細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。通過MTT法檢測培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞生長曲線,同時對細(xì)胞進(jìn)行糖原染色(Periodic Acid-Shiff stain,PAS)和膜蛋白CK18免疫化學(xué)鑒定,并觀察不同時期細(xì)胞形態(tài)。山麻鴨原代肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別加入200 μM α-亞麻酸(ALA,C18:3)和硬脂酸(SA,C18:0),誘導(dǎo)48h后,提取細(xì)胞總RNA、總蛋白質(zhì)和總脂肪酸,采用Real-time PCR法分析n-3 LCPUFAs合成相關(guān)基因的表達(dá),采用雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)及質(zhì)譜法分析差異表達(dá)蛋白質(zhì),采用質(zhì)譜法分析脂肪酸成分。結(jié)果顯示,SA和ALA顯著降低ELOVL2和FADS1基因的轉(zhuǎn)錄,SA顯著提高FADD2的轉(zhuǎn)錄;2-DE-質(zhì)譜法未檢測出與脂類代謝合成直接相關(guān)的差異表達(dá)蛋白;SA對SFAs、MUFA、n-3PUFAs、ALA、EPA和DHA含量影響均不顯著,ALA則顯著提高n-3 PUFAs、ALA和EPA的含量。該結(jié)果表明:1)ALA在肝細(xì)胞中能轉(zhuǎn)化為EPA和DHA,而SA則無此功能;2)ALA和SA都能改變n-3 LCPUFAs合成相關(guān)基因的表達(dá),但是機(jī)制還有待進(jìn)一步研究;3)2-DE法不適合進(jìn)行鴨肝細(xì)胞脂類代謝相關(guān)蛋白的差異分析。4.日糧魚油對山麻鴨不同腸道部位形態(tài)及微生物區(qū)系的影響以對照組山麻鴨5個腸道部位(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸)組織及其內(nèi)容物為研究對象,通過組織染色法及16S rDNA V3-V4區(qū)測序技術(shù)檢測其不同部位腸道形態(tài)及微生物群落的差異,同時研究基礎(chǔ)日糧添加2%魚油對腸道形態(tài)及微生物群落的影響。結(jié)果表明回腸絨毛高度和隱窩深度之比(VH/CD)最高,直腸次之。直腸具有最多杯狀細(xì)胞(GC),其他部位差異不顯著。魚油顯著降低回腸VH/CD,對其他腸道部位VH/CD影響不顯著,但魚油導(dǎo)致腸道絨毛變得窄瘦,甚至有些部位絨毛發(fā)生粘連。16S rDNA V3-V4區(qū)測序所獲得Clean Tags共分為1,987個操作分類單元(OTUs),獲得197個屬。十二指腸OTU數(shù)目最少,回腸OTU數(shù)目最多,魚油組各腸段OTU數(shù)目整體上低于對照組。Alpha多樣性分析表明十二指腸微生物多樣性最低,魚油顯著降低直腸微生物多樣性。從LEfSe(linear discriminant analysis coupled with effect size)分析結(jié)果中選取乳酸菌屬(Lactobacillus)、梭菌鋼(Clostridia)、巨單胞菌屬(Megamonas)和彎曲菌目(Campylobacterales)進(jìn)行細(xì)菌屬性分析。結(jié)果表明日糧添加2%魚油會傷害腸道形態(tài),降低腸道微生物的豐度和多樣性。本研究為全面了解山麻鴨不同腸道部位微生物組成提供了可靠依據(jù),并為比較魚油在山麻鴨生產(chǎn)中的添加效果提供了腸道方面的研究基礎(chǔ)。本文較全面的研究了基礎(chǔ)日糧添加不同油源對山麻鴨蛋品質(zhì)、蛋黃脂類成分肝臟脂類代謝和腸道微生物的影響,結(jié)果表明3個濃度(0.5%、1%和2%)的魚油、亞麻籽油、菜籽油和牛油均未顯著影響山麻鴨蛋品質(zhì),但是,魚油、亞麻籽油和菜籽油顯著增加了蛋黃n-3 PUFAs并顯著降低了蛋黃膽固醇含量;日糧添加2%魚油和2%亞麻籽油降在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控既有相同又有所不同,相同的是兩者都增加初級膽汁酸合成并降低脂肪酸合成,不同的是魚油促進(jìn)亞油酸代謝且降低n-3 LCPUFAs合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,而亞麻籽油則抑制亞油酸代謝和花生四烯酸代謝;另外,日糧添加2%魚油對山麻鴨腸道形態(tài)和微生物區(qū)系有不利影響。不同油源在蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)中的效果還有待結(jié)合飼料轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的評價。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S834

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本文編號：2428918