【摘要】：H5N1亞型高致病性禽流感(HPAI)是一種急性、高度接觸性的呼吸道疾病,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也可能引起人的感染發(fā)病,給公共衛(wèi)生帶來威脅。自1996年在我國廣東省的某發(fā)病鵝群中分離到第一株亞洲H5N1亞型高致病性禽流感病毒(HPAIV)以來,H5N1亞型HPAIV在經(jīng)歷一系列進(jìn)化后出現(xiàn)了多分支(clade 2.3.2.1、7.2和2.3.4.4)和多NA亞型(如H5N1、H5N2、H5N5、H5N6和H5N8等)的H5亞型禽流感病毒共流行的局面,因此迫切需要研制廣譜、可以鑒別自然感染和免疫的疫苗用于禽流感的控制。本研究以A/Mallard/Huadong/S/2005 (H5N1) (S, clade 2.3.4)為母本,對其NS1蛋白和HA蛋白進(jìn)行改造,通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救出NS1截短和嵌合HA病毒株,并評價(jià)重組病毒的生物學(xué)特性、致病性和免疫原性。1.NS1蛋白截短對H5N1亞型禽流感病毒的致弱作用及其機(jī)制研究以H5N1亞型S株為母本,利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建分別表達(dá)NS1蛋白N-末端48 aa、70　aa、73 aa和99 aa的S-NS48、S-NS70、S-NS73和S-NS99突變病毒,S-NS48在雞胚和CEF細(xì)胞中均表現(xiàn)出較弱的復(fù)制能力,其它NS1截短病毒均具有與母本病毒rS相當(dāng)?shù)膹?fù)制能力；以S-NS70、S-NS73和S-NS99感染SPF雞后僅在較易感染的肺部出現(xiàn)帶毒現(xiàn)象,感染后第3 d和5 d均可在喉頭及泄殖腔棉拭子中檢測到NS1截短病毒,同時(shí)IVPI分別為0.65、0.74和0.84,說明NS1蛋白截短后對雞的毒力顯著下降；NS1蛋白的截短也使病毒對小鼠的致病力顯著下降,S-NS70、S-NS73和S-NS99對BALB/c小鼠的MLD＞106.5EID50,小鼠感染NS1截短病毒后僅在肺部檢測到一定量的感染毒。通過高通量測序分析rS和S-NS99感染SPF雞后誘導(dǎo)宿主基因的差異表達(dá),在差異最顯著的10個(gè)基因中,雞感染rS后出現(xiàn)趨化因子基因CCL19、CCL4,干擾素相關(guān)基因OAS*A基因和細(xì)胞因子IL-6基因的顯著上調(diào)；感染S-NS99后出現(xiàn)趨化因子基因CCL19、CCL4、CCLI10,干擾素相關(guān)基因IFN-β、IFN-λ、IRG1、Mx、OAS*A基因的顯著上調(diào)。GO功能富集性分析表明感染rS后機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)、趨化因子活性、細(xì)胞因子活性、炎癥反應(yīng)、防御病毒反應(yīng)、防御反應(yīng)和病毒反應(yīng)等；但感染S-NS99后的抗病毒功能的富集明顯較少,僅有炎癥反應(yīng)、防御病毒反應(yīng)、病毒反應(yīng)和免疫反應(yīng)。KEGG信號通路分析表明,感染rS后在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、NOD樣受體信號通路、p53信號通路和RIG-I樣受體信號通路相關(guān)基因等發(fā)生顯著變化；而感染S-NS99后僅出現(xiàn)Toll樣受體信號通路相關(guān)基因的顯著變化,提示H5N1亞型高致病性禽流感病毒NS1蛋白截短后未能激活宿主相關(guān)通路基因,無法引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”而使其毒力下降。2.H5N1亞型禽流感病毒Nsl截短減毒活疫苗的研制以H5N1亞型S株為母本,通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救出裂解位點(diǎn)為低致病性特征的HA蛋白和截短N(yùn)S1蛋白的S-HALo/NS48、S-HALo/NS70、S-HALo/NS73和S-HALo/NS99突變病毒,研究表明帶有低致病HA的NS1截短病毒在雞胚和CEF中的生長能力,對SPF雞和BALB/c的致病特性與高致病性HA的NSl截短病毒相似。SPF雞免疫S-HALo/NS70、S-HALo/NS73和S-HALo/NS99后第3 d誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β明顯高于全長NS1蛋白的重組病毒S-HALo/NSFu,但隨后IFN-β的表達(dá)量下降,與S-HALo/NSF u病毒差異不顯著。用流式細(xì)胞術(shù)對免疫雞外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析表明,免疫后各免疫組因CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著上調(diào)而使CD4+/CD8+比例低于空白對照組,其中以S-HALo/NS73組變化最為明顯,說明其細(xì)胞免疫反應(yīng)最為強(qiáng)烈。攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明NSl截短病毒免疫后均可對同源H5N1強(qiáng)毒S株攻擊提供100%的保護(hù)力,但S-HALo/NS73無排毒現(xiàn)象；而用異源強(qiáng)毒株DT(clade 7.2).WX(clade 2.3.2.1).CZG(clade 2.3.4.4)攻擊時(shí),僅有S-HALo/NS73免疫組提供100%的異源保護(hù)力,排毒率也較其它NS 1截短病毒免疫組低,有望成為一株雞用H5N1亞型禽流感減毒活疫苗的候選株。3.HA莖部嵌合型H5N1亞型禽流感病毒DIVA疫苗的研制以H5N1亞型S株和H3N2亞型流感病毒YCD、SB和YZ HA基因?yàn)槟０?構(gòu)建表達(dá)H5頭部和H3莖部嵌合病毒cH5head/H3stalk-YCD、cH5head/H3stalk-SB和cH5head/H3stalk-YZ,3株H5/H3嵌合病毒在雞胚中具有與野生型S-HALO一致的生長曲線。用嵌合病毒cH5 head/H3 stalk-YCD免疫SPF雞后對母本強(qiáng)毒S株攻擊的保護(hù)率為80%。隨后原核表達(dá)H5 HA2亞基,以融合蛋白rH5-HA2作用包被抗原建立檢測H5 HA2抗體的間接ELISA方法,其最佳抗原包被量為1.6μg/ml,血清稀釋倍數(shù)為1：160。該ELISA方法對常見的家禽病原(IBV、NDV、ILTV、H9亞型、H3亞型、大腸桿菌和沙門菌)的血清交叉反應(yīng)性弱,敏感性試驗(yàn)表明間接ELISA方法(1：3200)比間接免疫熒光(1：800)敏感,可用于DIVA策略的臨床實(shí)踐。用已建立的檢測H5 HA2抗體的間接ELISA方法對H5/H3嵌合疫苗免疫后21 d和H5病毒攻毒后14 d雞血清進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示免疫后21 d H5/H3嵌合病毒免疫組血清均為HA2抗體為陰性,而攻毒后血清由陰轉(zhuǎn)陽,說明該間接ELISA方法可有效區(qū)分感染和免疫血清。4.HA頭部嵌合型H5N1亞型禽流感疫苗的跨分支保護(hù)作用研究以H1亞型和H5亞型流感病毒HA基因?yàn)槟０?構(gòu)建表達(dá)H1頭部和H5莖部重組嵌合病毒cH1head/H5stalk,嵌合病毒在雞胚中具有與野生型S-HALo一致的生長曲線。以S-HALo和cH1head/H5stalk滅活乳化后對S-HALo基礎(chǔ)免疫雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫,同源S株攻毒時(shí)S-HALo組和cH1head/H5stalk組均可提供100%的保護(hù)力,且未見排帶毒現(xiàn)象。當(dāng)免疫雞受到不同clade的異源強(qiáng)毒DT、WX、CZG攻擊時(shí),cH1head/H5 stalk組除可提供100%的保護(hù)率,且排毒較S-HALo組少。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：2426229