【摘要】：本論文旨在研究植物乳桿菌(LP)對感染產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)K88的腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)屏障功能、轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)及免疫反應(yīng)的影響。試驗分成3個部分:試驗一:1)選取不同濃度ETEC K88(MOI=10、25、50、75和100)攻毒IPEC-J2細(xì)胞不同時間(1、2、3和4 h),通過測定細(xì)胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達(dá),確定ETEC-K88的最佳攻毒濃度和時間,建立ETEC K88-IPEC-J2互作模型;2)選取不同濃度的LP(MOI=10、25、50、75和100)預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞不同時間(3、6和9 h)并攻毒,通過測定細(xì)胞存活率、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達(dá),確定LP的最佳處理濃度和時間,建立LP-IPEC-J2互作模型;3)通過測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量,確定LP-IPEC-J2-ETEC K88互作模型。結(jié)果表明:1)與對照組相比,ETEC K88(MOI=50)攻毒IPEC-J2細(xì)胞3 h后,細(xì)胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05);因此,確定ETEC K88與IPEC-J2互作的最佳模型為MOI=50,培養(yǎng)時間3 h;2)與ETEC K88對照組相比,LP(MOI=75)預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞6 h后,細(xì)胞中促炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05);因此,確定LP與IPEC-J2互作的最佳模型為MOI=75,培養(yǎng)時間為6 h;3)與對照組相比,ETEC K88(MOI=50)攻毒IPEC-J2細(xì)胞3 h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量顯著升高(P0.05),而與ETEC K88組相比,LP預(yù)處理后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8及TNF-α的含量顯著降低(P0.05);綜上,我們確定ETEC-IPEC-J2-LP互作模型為:LP(MOI=75,約為1×108 CFU)預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞6 h后,再進(jìn)行ETEC K88(MOI=50,約為6.5×107 CFU)攻毒IPEC-J2細(xì)胞3 h。試驗二:將IPEC-J2細(xì)胞接種于與Transwell 6孔板,細(xì)胞分化后(約為1.3×106個/孔),在試驗一確定的互作模型條件下,對細(xì)胞進(jìn)行LP預(yù)處理和ETEC K88攻毒,之后收集細(xì)胞并保存待測定。試驗中,未做任何處理的細(xì)胞定為對照組,單獨做LP預(yù)處理的細(xì)胞定為LP組,單獨做ETEC K88攻毒的細(xì)胞定為K88組,LP預(yù)處理后進(jìn)行攻毒的細(xì)胞定為LP+K88組,每組共6個重復(fù)(孔)。結(jié)果表明:1)與對照組相比,eteck88攻毒后,ipec-j2細(xì)胞teer值顯著下降(p0.05);細(xì)胞中緊密連接claduin-1、occludin、zo-1的mrna表達(dá)(p0.05)及claudin-1及occludin的蛋白表達(dá)顯著下降(p0.05);與k88組相比,lp預(yù)處理后能夠顯著抑制eteck88誘導(dǎo)的細(xì)胞teer值的下降(p0.05)、抑制eteck88誘導(dǎo)的細(xì)胞中claudin-1、occludin、zo-1的mrna表達(dá)(p0.05)及occludin蛋白表達(dá)的下降(p0.05);激光共聚焦的結(jié)果與上述結(jié)果一致,表明eteck88能夠破壞緊密連接claudin-1及occludin的表達(dá),而lp預(yù)處理可以緩解eteck88對ipec-j2細(xì)胞緊密連接的破壞。2)與對照組相比,eteck88攻毒后,ipec-j2細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體sglt1、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+lat1、cat1和asct2的mrna表達(dá)均顯著下調(diào)(p0.05)、氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體cftr及nkcc1的mrna表達(dá)均顯著上調(diào)(p0.05);與k88組相比,lp預(yù)處理后能顯著抑制ipec-j2細(xì)胞中上述葡萄糖及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mrna表達(dá)的下調(diào)(p0.05)、抑制細(xì)胞中上述氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體mrna表達(dá)的上調(diào)(p0.05);無論是lp預(yù)處理還是k88攻毒均對細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體glut2、sglt3及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體cat2、b0,+at的mrna表達(dá)無顯著影響(p0.05)。3)與對照組相比,eteck88攻毒后,ipec-j2細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子il-1β、il-6、il-8及tnf-α的mrna表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05),而抗炎性細(xì)胞因子tgfβ及ppar-γ的mrna表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05);ipec-j2細(xì)胞中tlr1、tlr2、tlr6、tlr9的mrna表達(dá)及tlr2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05),而tlr5和tlr7的mrna表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05);細(xì)胞中tlr負(fù)調(diào)控因子sigirr、bcl3和mkp-1的mrna表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05)。與k88組相比,lp預(yù)處理后,能夠抑制促炎性細(xì)胞因子il-1β、il-8及tnf-α的mrna表達(dá)的上調(diào)(p0.05),抑制抗炎性細(xì)胞因子tgfβ及ppar-γ的mrna表達(dá)的下調(diào)(p0.05),抑制eteck88誘導(dǎo)的tlr4、tlr5和tlr7的mrna表達(dá)的升高及tlr2mrna和蛋白表達(dá)的降低(p0.05),抑制eteck88誘導(dǎo)的sigirr、bcl3和mkp-1的mrna表達(dá)的下調(diào)(p0.05)。此外,lp單獨預(yù)處理細(xì)胞后,能夠顯著上調(diào)細(xì)胞中ppar-γ、tlr6及bcl3的mrna表達(dá)(p0.05)。無論是lp預(yù)處理還是k88攻毒處理細(xì)胞后,細(xì)胞中tlr3、tollip、a20及irak-m的mrna表達(dá)均無顯著變化(p0.05)。試驗三:將ipec-j2細(xì)胞接種于與transwell6孔板,細(xì)胞分化后(約為1.3×106個/孔),將lp(1×108cfu/well)與細(xì)胞于37°c、5%co2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6h后,去除培養(yǎng)上清并用PBS清洗細(xì)胞。之后用ETEC K88(MOI=50,約為6.5×107CFU)攻毒細(xì)胞。在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、12、25和50 min后,去除培養(yǎng)上清,PBS清洗細(xì)胞。之后收集細(xì)胞并測定P38、p-P38及IκBα的蛋白表達(dá)。試驗中單獨做ETEC K88攻毒的細(xì)胞定為K88組,LP預(yù)處理后進(jìn)行攻毒的細(xì)胞定為LP+K88組,每組共6個重復(fù)(孔)。結(jié)果表明:與K88組相比,K88攻毒12、25及50 min后,LP預(yù)處理的細(xì)胞中IκBα的蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05);K88攻毒25 min和50 min后,LP預(yù)處理的細(xì)胞中p-P38的蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),即表明LP可以一定程度上抑制ETEC K88誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號通路。綜上所述,LP預(yù)處理能夠緩解ETEC K88誘導(dǎo)的促炎性因子的表達(dá)上調(diào)及抑炎性因子表達(dá)的下調(diào),進(jìn)而通過維持腸上皮細(xì)胞緊密連接mRNA及蛋白表達(dá)、維持腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體及下調(diào)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá),發(fā)揮保護(hù)腸上皮細(xì)胞屏障功能及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的作用。LP這種保護(hù)作用的發(fā)揮可能是通過調(diào)節(jié)TLRs、NF-κB和MAPK信號通路來實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2425723