本文關(guān)鍵詞：苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒ac130（gp16）和ac132的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《安徽醫(yī)科大學》 2015年

補體C3及其缺失突變體與CLIC1蛋白相互作用的初步研究

王二寧  

【摘要】：目的本實驗為研究C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白與CLIC1蛋白的相互作用,分別構(gòu)建帶FLAG標簽的C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)的真核表達載體,將C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染至COS7細胞,觀察各組分蛋白在細胞中的定位;構(gòu)建缺失突變體酵母表達載體,進行酵母雙雜交實驗;通過將C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)質(zhì)粒與CLIC1蛋白共同瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞,通過免疫共沉淀技術(shù),在哺乳動物細胞內(nèi),檢測C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白與CLIC1蛋白的相互作用。方法根據(jù)PCR方法分別擴增野生型C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)序列,酶切回收目的片段,插入到p CDNA3.1載體上,構(gòu)建p CDNA3.1-C3-FLAG、p CDNA3.1-C3(1-840)-FLAG、p CDNA3.1-C3(824-1663)-FLAG質(zhì)粒;用同樣的方法構(gòu)建p GADT7-C3(1-840)、p GADT7-C3(824-1663)、p GBKT7-C3(1-840)和p GBKT7-C3(824-1663)酵母表達載體,對于酶切鑒定正確的質(zhì)粒,跟Marker對比后正確的送往測序公司測序。分別將C3的缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)和CLIC1的酵母表達載體,共同轉(zhuǎn)化至酵母菌AH109中,在SD/-Leu/-Trp/-His/3AT/X-α-gal固體培養(yǎng)基上進行篩選,利用酵母雙雜交技術(shù),檢測C3的缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)和CLIC1蛋白在酵母細胞中大致的蛋白質(zhì)相互作用。把已構(gòu)建成功的p CDNA3.1-C3-FLAG、p CDNA3.1-C3(1-840)-FLAG、p CDNA3.1-C3(824-1663)-FLAG質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到COS7細胞中,細胞制片后在熒光顯微鏡下觀察;分別將帶FLAG標簽的C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)與帶GFP標簽的CLIC1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到HEK 293T細胞,通過免疫共沉技術(shù),檢測C3及其缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在HEK 293T細胞中的相互作用。結(jié)果根據(jù)測序公司的測序結(jié)果比對基因序列確定構(gòu)建是否成功。酵母實驗中,共表達C3及其缺失突變體C3(1-840)與CLIC1兩種融合蛋白后細胞沒有變藍,而共表達C3(824-1663)與CLIC1兩種融合蛋白后,在酵母盤子中有細胞變藍,說明有相互作用;在免疫熒光顯微鏡下觀察,在COS7細胞中,C3及其缺失突變體C3(1-840)、C3(824-1663)蛋白主要分布在細胞質(zhì)中,在細胞核中幾乎沒有,CLIC1蛋白的分布主要在細胞核內(nèi),尤其是在核膜上,細胞質(zhì)中較少分布;而C3(824-1663)的缺失突變體蛋白的定位除在細胞質(zhì)中分布外,在核膜處有斑點集中分布。共定位實驗觀察到缺失突變體C3(824-1663)與CLIC1蛋白在細胞質(zhì)中有共定位現(xiàn)象,而C3和缺失突變體C3(1-840)與CLIC1蛋白在細胞質(zhì)中不存在明顯的共定位。根據(jù)免疫共沉淀的結(jié)果顯示,在HEK 293T細胞中,C3和C3(1-840)與CLIC1蛋白不存在相互作用。結(jié)論通過以上實驗證明了C3和C3(1-840)蛋白與CLIC1蛋白在細胞中沒有相互作用,C3(824-1663)與CLIC1蛋白在細胞內(nèi)可能存在相互作用。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

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