【摘要】：結(jié)球甘藍(Brassica oleracea var. capitata L.),是十字花科蕓薹屬作物,簡稱甘藍,是世界上最重要的葉用類蔬菜作物之一,在我國蔬菜生產(chǎn)與周年供應中具有重要的地位。甘藍的營養(yǎng)生長經(jīng)歷幼苗期、蓮座期和結(jié)球期,球葉向上向內(nèi)卷曲生長,在結(jié)球期呈現(xiàn)半抱合狀態(tài)。對多數(shù)植物來而言,葉片卷曲破壞了葉片的平展性,影響其葉片正常的生理功能包括呼吸作用、光合作用、蒸騰作用等,但對以葉球為食用器官的結(jié)球甘藍等作物而言卻是一種極有用的農(nóng)藝性狀。球葉的數(shù)量與卷曲程度直接影響結(jié)球甘藍產(chǎn)品器官的單球重和葉球緊實度這兩大商品性狀。結(jié)球甘藍葉球的形成受內(nèi)源激素、光照、溫度、營養(yǎng)、水分等因素的影響,是一個在環(huán)境因素誘導下的基因調(diào)控下的復雜生物學發(fā)生過程。葉片向內(nèi)向上卷曲是結(jié)球甘藍結(jié)球的重要特征,這為研究結(jié)球甘藍葉片卷曲的機制提供了材料。植物體接受外界信號刺激從而展開發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是其基因的表達與調(diào)控,所以對結(jié)球甘藍結(jié)球過程中葉片卷曲關(guān)聯(lián)基因與其表達的研究,將有助于解析結(jié)球甘藍結(jié)球的分子機制,并為利用分子育種技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的結(jié)球甘藍品種提供理論依據(jù)。作為一類植物中與發(fā)育有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子,同源異型盒(homeobox, HB)蛋白最顯著特征就是具有同源異型域(homeodomain, HD),它是由61或60個氨基酸組成的一個高度保守的結(jié)構(gòu)域。植物同源異型盒蛋白家族根據(jù)同源異型域序列和位置的差異,以及它兩側(cè)序列的同源性與其他保守結(jié)構(gòu)域的不同,可以分為六大類,其中作為高等植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子——同源異型-亮氨酸拉鏈蛋白(HD-Zip),在植物細胞分化過程中有重要調(diào)控作用,]HD-Zip又分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個亞類。已有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh]的葉極性調(diào)控基因HYL1 (HYPONASTIC LEA VES1)調(diào)節(jié)HD-Zip Ⅲ基因的表達是通過介導miRNA來進行的,HYL1基因缺失突變體hyl1表現(xiàn)葉片向內(nèi)卷曲,增量表達PHB、PHV、REV這3個HD-Zip Ⅲ基因,說明HD-Zip類基因與葉片卷曲調(diào)控相關(guān)聯(lián)。為了進一步了解在甘藍結(jié)球過程中球葉卷曲調(diào)控中同源異型盒基因的作用。本研究以結(jié)球性良好的‘519’甘藍品系為試材,從轉(zhuǎn)錄組測序出發(fā),以同源異型盒基因為研究對象,通過甘藍蓮座期葉片與球葉形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)比較研究、與甘藍結(jié)球過程中葉片卷曲相關(guān)的同源異型盒基因的克隆與分析、目的基因啟動子GUS表達分析以及目標基因轉(zhuǎn)化甘藍的研究,闡述了同源異型盒基因在甘藍結(jié)球過程中對葉片卷曲的重要調(diào)節(jié)作用。本研究主要獲得了以下幾個方面的結(jié)果：1.甘藍蓮座期葉片和結(jié)球期球葉的形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)比較通過同等大小的甘藍蓮座期葉與球葉的形態(tài)學觀察,并且通過石蠟切片法對葉片不同區(qū)域部位組織結(jié)構(gòu)進行細胞學觀察,結(jié)果表明：相對于綠色有葉柄葉片平展的蓮座期葉片,甘藍球葉淺黃色,無葉柄,葉片向上卷曲,葉形指數(shù)較��；相對于蓮座葉,球葉的葉片厚度增加,葉片中葉肉細胞分化發(fā)育相對蓮座葉延遲,只在葉片頂部區(qū)域分化發(fā)育出細胞排列緊密的柵欄組織和松散的海綿組織,葉片中部區(qū)域沒有分化發(fā)育出柵欄組織和海綿組織,而蓮座葉在葉片中部區(qū)域就已經(jīng)分化發(fā)育出了柵欄組織和海綿組織。對甘藍植株進行了高溫脅迫和壓葉處理后的球葉形態(tài)變化觀察。結(jié)果表明：在自然狀態(tài)下519甘藍第34片葉為卷曲的球葉,而在30℃高溫處理下和壓葉處理后,第34片葉的形態(tài)變得更接近蓮座葉。這說明了高溫、光照等外界環(huán)境條件的變化對甘藍的結(jié)球與葉片卷曲有影響。2.通過轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的甘藍同源異型盒基因的克隆與表達分析通過結(jié)球期莖尖和葉片以及蓮座期莖尖和葉片的轉(zhuǎn)錄組分析,從中篩選出表達差異顯著的4個HB類基因,分別為BoHB12.BoHB7、BoHAT2 和 BoHB27。進一步對上述4個基因以及調(diào)控擬南芥葉片卷曲但在結(jié)球甘藍轉(zhuǎn)錄組中未檢測到表達差異的BoPHB、BoPHV 和 BoREV進行了同源克隆。序列分析表明上述7個基因都含有同源異型域,具有同源異型盒蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征。BlastP(蛋白序列與蛋白庫做比對)表明它們與擬南芥的同源蛋白相似性高,來自結(jié)球甘藍的BoHB12、BoHB7、BoHAT2、BoHB27、BoPHV、BoPHB、BoREV與擬南芥中的ATHB12、ATHB7、HAT2、ATHB27、PHV、PHB、REV蛋白同源,它們的同源性分別為80%、79%、86%、60%、95%、94%和96%。BlastP比對和進化樹分析結(jié)果表明,BoHAT2屬于HD-Zip Ⅱ類,BoHB12和BoHB7屬于HD-ZipⅠ類,BoHB27屬于ZF-HD,BoPHB、BoPHV和BoREV屬于HD-Zip Ⅲ類。BoHB12、 BoHB7、BoHAT2、BoHB27、BoPHB、BoPHV、BoREV在結(jié)球甘藍蓮座期到結(jié)球期的莖尖和葉片中均有表達,BoHB12 和 BoHB7在結(jié)球期葉片中表達量顯著增高,分別是蓮座期葉片的38.1倍和6.2倍,其余基因表達量差異不明顯,表明BoHB12和BoHB7可能在結(jié)球甘藍球葉自然卷曲過程中的起到了主效調(diào)控作用。3. BoHB12 與 BoHB7基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達特性分析本研究分別構(gòu)建了BoHB12 與 BoHB7兩個基因的啟動子的含GUS報告基因的植物表達載體pCABarBoHB12PGUS 和 pCABarBoHB7PGUS,并通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化獲得了相應的煙草轉(zhuǎn)基因植株。通過轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色分析,結(jié)果表明,BoHB12的啟動子在植株中在葉、莖部和根尖都有表達,而在幼葉中只在基部和葉尖表達,而且活性低；BoHB7的啟動子在植株中葉、莖和根部都有表達,在幼葉中活性較低。4. BoHB12、BoHB7基因的甘藍遺傳轉(zhuǎn)化研究在構(gòu)建中間載體時,通過酶切連接,同時將一個基因分兩個方向隨機插入到載體pBI525上,然后用其上游引物+NOS-R引物進行PCR擴增,鑒別該基因的插入方向,這就同時構(gòu)建了一個基因的正義鏈中間載體和反義鏈中間載體。又通過酶切連接將正義鏈和反義鏈分別插入植物表達載體PCAMBIA1300-bar上,構(gòu)建了正義表達載體pCABarBoHB12 和 pCABarBoHB7與反義表達載體pCABar anti-BoHB12 和 pCABaranti-BoHB7四個植物表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導和組織培養(yǎng)的方法轉(zhuǎn)化獲得了相應的甘藍轉(zhuǎn)基因植株(35S::anti-BoHB7轉(zhuǎn)基因不定芽未能生根)。其中BoHB12反義基因轉(zhuǎn)化獲得的甘藍35S::anti-BoHB12轉(zhuǎn)基因植株的表型發(fā)生明顯變化,蓮座期葉片變小,葉面褶皺,葉片向下卷曲,不能形成葉球,與非轉(zhuǎn)基因植株葉片完全不同。通過對35S::BoHB12轉(zhuǎn)基因植株和35S::anti-BoHB12轉(zhuǎn)基因植株蓮座期葉片中的BoHB12、BoGA20ox1、BoGA20ox2、 BoASA1、BoILL6、BoIAA12、BoTCP4、BoPHB、BoPHV進行定量PCR分析,結(jié)果表明,35S::Bo HB12轉(zhuǎn)基因植株蓮座期葉片中的BoHB12基因過表達,35S::anti-BoHB12轉(zhuǎn)基因植株蓮座期葉片中的BoHB12基因表達受到抑制；BoHB12主要調(diào)控BoGA20ox1的表達,還負調(diào)控BoIAA12 和 BoPHV的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S635.1

【參考文獻】

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2 蘇金,吳瑞;水稻中轉(zhuǎn)基因表達的“位置效應”初報[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報;1999年04期

3 李星;李亞寧;楊文香;劉大群;;基因表達系列分析技術(shù)及其在植物抗病性研究中的應用[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報;2006年05期

4 閆海生;雷闖;馬凌霄;劉紅雙;馬景勇;;轉(zhuǎn)OsCYP2基因水稻后代的遺傳分析及農(nóng)藝性狀觀察[J];湖北農(nóng)業(yè)科學;2013年07期

5 魏文輝,宋運淳,覃瑞;植物同源異型基因及同源異型盒基因的研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2000年02期

6 陳杰;大規(guī)模平行測序技術(shù)(MPSS)研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2004年08期

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9 黃永芬,汪清胤,付桂榮,趙曉祥,楊志興;美洲擬鰈抗凍蛋白基因(afp)導入番茄的研究[J];生物化學雜志;1997年04期

10 王念,王軍輝,張建國,張守攻;轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展狀況及外源基因在后代中遺傳分離研究進展[J];生物技術(shù)通報;2004年01期

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本文編號：2406660