【摘要】：小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一種急性接觸性和高度致死性的烈性傳染病。其特征是發(fā)熱急、高熱稽留、口炎、腹瀉和肺炎。對綿羊、山羊等小反芻動物危害嚴重,山羊發(fā)病嚴重,易感羊群的發(fā)病率和死亡率可達100%,野生動物也可感染。是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列出的通報(notifiable)疫病,也是我國農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的一類動物疫病。此病1942年首先在非洲的科特迪瓦發(fā)生,目前在全球70多個國家流行,包括中東、非洲和亞洲大部,是一種跨境動物傳染病,對發(fā)展中國家畜牧生產(chǎn)造成了嚴重的影響。鑒于PPR目前在全球的傳播形勢,2015年OIE與世界糧農(nóng)組織(FAO)正式啟動了PPRV根除計劃(GCES),計劃于2030年前全球根除PPR。我國于2007年7月首次在西藏阿里地區(qū)暴發(fā)PPR疫情,自2013年11月起小反芻獸疫在我國多個省市地區(qū)連續(xù)發(fā)生,疫情傳播快、跨度大、風險高,為此,農(nóng)業(yè)部于2015年12月印發(fā)了《全國小反芻獸疫消滅計劃(2016—2020年)》,對國內(nèi)該病的防控工作提出了新的要求�；�2010年人類實現(xiàn)牛瘟全球根除的成功經(jīng)驗,敏感快速的診斷方法對于PPR的防控及根除至關重要。傳統(tǒng)診斷方法如病毒分離、血清中和試驗、瓊脂免疫擴散試驗等,或費時費力,或特異性和敏感性不高;新型診斷方法如RT-PCR、熒光定量RT-PCR等試驗,雖然較為快速敏感,但需要特殊設備且只能由專業(yè)技術(shù)人員在實驗室中完成,不能滿足基層實驗室或臨床現(xiàn)場快速檢測的需求。為實現(xiàn)2018年,全國所有免疫省份達到免疫無小反芻獸疫區(qū)的要求,實驗室或基層現(xiàn)場一方面需要對大批量免疫動物進行快速特異性診斷、及時評價免疫效果,另一方面由于國內(nèi)PPRV弱毒活疫苗(Nigeria75/1株)的使用,實驗室檢測中難以區(qū)分疫苗株和野毒株,不利于PPR疫情的流行病學調(diào)查及最后階段的防控根除。為此,本研究針對上述實際工作需求,探索建立了一套適用于基層根除防控的實用快速檢測方法,包括第一步在臨床現(xiàn)場對PPRV免疫后效果進行快速評估(Post vaccination evaluaton,PVE),其次在實驗室對感染情況進一步進行血清學篩查(流行病學調(diào)查),如果發(fā)現(xiàn)PPRV感染,則對PPRV疫苗株及野毒株進行實驗室鑒別診斷(Differentiation of infected and vaccinated animals,DIVA),通過上述檢測,掌握免疫情況及感染狀況,為下一步的防控措施提供科學依據(jù),是小反芻獸疫最終實現(xiàn)凈化根除檢測技術(shù)的應用型研究。具體研究內(nèi)容包括:使用水溶性羧基功能化量子點(QDs)作為熒光標記,通過酰胺鍵與鏈球菌G蛋白(SPG)共軛,經(jīng)QDs標記的SPG與PPRV抗體(IgG)結(jié)合,再與檢測線上的昆蟲桿狀病毒表達的AcNPV-PPRV-N重組蛋白發(fā)生免疫反應,在365nm的紫外線激發(fā)光下可見高亮的熒光帶,建立了檢測PPRV血清抗體的新型超敏熒光量子點免疫層析快速檢測技術(shù)(QDs-LFIAS)。該方法抗體濃度與熒光強度直接關聯(lián),使用成本低廉、維護保養(yǎng)簡單的儀器在15min內(nèi)讀取結(jié)果。評估其分析敏感性(Analytical Sensitivity,ASe)明顯優(yōu)于競爭ELISA檢測方法(Competitive ELISA,C-ELISA)(OIE推薦的血清學檢測金標準)及膠體金免疫層析技術(shù)(Immunochromatographic Strip ICS)。檢測藍舌病、犬瘟熱、羊痘及口蹄疫病毒陰性,分析特異性(Analytical Specificity,ASp)100%。與C-ELISA檢測方法同時檢測臨床樣本,評估其診斷特異性(Diagnostic Specificity,DSp)及敏感性(Diagnostic Sensitivity,DSe)分別為99.47%和97.67%,一致性良好,適用于臨床現(xiàn)場對小反芻獸疫的免疫效果進行快速評價(PVE)。2.小反芻獸疫病毒雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)快速檢測方法的建立及評估利用免疫雜交瘤細胞技術(shù),篩選獲得穩(wěn)定分泌PPRV單克隆抗體(Monoclonial Antibody,MAb)的雜交瘤細胞株(5B11),利用該細胞株產(chǎn)生的針對PPRV N抗原的特異性MAb以及PPRV疫苗株全病毒免疫蛋雞獲取的PPRV特異性雞卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin,IgY),建立了檢測血清中PPRV抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)新型快速實用檢測方法。評估其分析特異性(ASp)結(jié)果顯示,該方法檢測PPRV陽性樣品結(jié)果為陽性,檢測藍舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水皰性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒為陰性,特異性100%。與RT-PCR方法同時檢測臨床樣品,評估其DSp和DSe分別為99.2%和93.9%,兩種方法檢測結(jié)果的符合率為98.1%。重復性檢測結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)在2.14%~6.18%之間,批間變異系數(shù)在4.82%~8.37%之間,表明建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法重復性良好,適用于對小反芻獸疫免疫帶毒或野毒感染情況進行實驗室快速血清學篩查及流行病學調(diào)查。3.區(qū)分小反芻獸疫疫苗株與野毒株的實時熒光定量RT-PCR鑒別診斷方法的建立及評估對我國西藏地區(qū)使用的PPRV弱毒活疫苗毒株(Nigeria75/1)進行全基因組序列測定,分析比較已報道的PPR西藏野毒株的基因組核酸序列,選擇兩者差異較大的特異區(qū)段設計了2套實時熒光RT-PCR的引物和TaqMan探針分別用于檢測PPRV疫苗株和野毒株,篩選最佳的引物、探針濃度,優(yōu)化反應體系和條件,針對我國PPRV防控實際需要,建立了區(qū)分小反芻獸疫活疫苗株與野毒株(differentiation of infected1.小反芻獸疫血清抗體超敏熒光量子點免疫層析快速檢測技術(shù)(QDs-LFIAS)的建立及評估and vaccinated animals,DIVA)的新型實時熒光定量RT-PCR快速鑒別診斷方法。特異性分析結(jié)果顯示,檢測疫苗株的熒光RT-PCR只能檢測到PPR疫苗毒株,檢測對照病毒及PPR野毒株均為陰性;檢測野毒株的熒光RT-PCR只能檢測到PPR野毒株,檢測對照病毒及PPR疫苗株均為陰性,說明建立的上述鑒別診斷方法特異性強。靈敏度(Limit of detection,LOD)分析表明,檢測疫苗株的熒光RT-PCR最低檢出核酸數(shù)量級為1.38pg/μL,檢測野毒株的熒光RT-PCR最低檢出核酸數(shù)量級為0.16pg/μL,適用于我國目前防控PPRV對PPRV感染動物及免疫動物進行實驗室鑒別診斷(DIVA)及流行病學調(diào)查,是我國在2020年前最終實現(xiàn)PPRV根除的必要技術(shù)手段。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3

【參考文獻】

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1 曲香云;;小反芻獸疫的防控措施[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2014年08期

2 朱迪國;宋建德;袁麗萍;魏榮;;全球小反芻獸疫流行趨勢[J];中國動物檢疫;2014年06期

3 王凈;李剛;史利軍;;間接ELISA和競爭ELISA檢測小反芻獸疫病毒抗體的比較[J];畜牧獸醫(yī)學報;2014年02期

4 翁善鋼;;小反芻獸疫的流行、診斷與防控[J];中國草食動物科學;2012年06期

5 龍云鳳;劉曉慧;周曉黎;祝賀;艾軍;董俊;葉玲玲;陳朝銀;;小反芻獸疫流行病學及防控研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2012年05期

6 印春生;支海兵;王樂元;薛青紅;李寧;王玉紅;李潤;黃炯;張德坤;;小反芻獸疫活疫苗臨床試驗研究[J];中國獸藥雜志;2010年07期

7 賈鳳芹;李剛;李偉;史利軍;胡小華;;小反芻獸疫病毒間接ELISA抗體檢測方法的建立與初步應用[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年12期

8 于紅;焦光月;李鵬;田泰安;鄭明學;馬海利;;小反芻獸疫流行情況及防控措施[J];畜禽業(yè);2009年06期

9 李偉;李剛;范曉娟;張坤;賈風琴;史利軍;Hermann Unger;;快速檢測小反芻獸疫病毒RT-LAMP方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2009年05期

10 南文金;王清華;吳曉東;包靜月;王志亮;;小反芻獸疫病毒分子生物學與疫苗研究進展[J];中國動物檢疫;2009年01期

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1 蒙學蓮;小反芻獸疫病毒血凝素蛋白及其受體的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

2 張喜悅;小反芻獸疫（PPR）ELISA及PCR診斷方法的建立[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2008年

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本文編號：2387441