【摘要】：雜擬谷盜和玉米象是重要的儲(chǔ)糧害蟲,造成儲(chǔ)糧巨大損失,化學(xué)熏蒸劑的使用受到毒性和環(huán)境安全的嚴(yán)重制約。研發(fā)高效安全的儲(chǔ)糧害蟲控制藥劑在實(shí)踐中具有重要的意義。本論文研究了互葉白千層精油對(duì)雜擬谷盜(Tribolium confusum Jac.du Val.)、玉米象(Sitophilus zeamais)等儲(chǔ)糧害蟲的殺蟲活性,明確了互葉白千層精油的主要?dú)⑾x活性成分,探討了互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲殺蟲作用的生化機(jī)理和分子機(jī)制,開(kāi)展了互葉白千層精油防治儲(chǔ)糧害蟲的實(shí)倉(cāng)模擬試驗(yàn),并對(duì)互葉白千層精油安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià),為植物源農(nóng)藥的研究開(kāi)發(fā)、儲(chǔ)糧害蟲的綠色防控以及保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:1、互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲的殺蟲作用以儲(chǔ)糧害蟲雜擬谷盜和玉米象為研究對(duì)象,研究了不同濃度和時(shí)間梯度的互葉白千層精油對(duì)供試?yán)ハx的驅(qū)避作用、觸殺作用和熏蒸作用,旨在探討不同作用方式的互葉白千層精油對(duì)試蟲的殺蟲活性效果。結(jié)果表明:互葉白千層精油對(duì)雜擬谷盜和玉米象的驅(qū)避效果明顯,在濃度為1.41mg/cm~2下對(duì)雜擬谷盜和玉米象的平均驅(qū)避率分別是77.60%、75.68%,其驅(qū)避等級(jí)達(dá)Ⅳ級(jí);互葉白千層精油對(duì)雜擬谷盜和玉米象都具有良好的觸殺作用,24h時(shí)其觸殺活性的LD_(50)分別為4.70mg/cm~2、4.80mg/cm~2;互葉白千層精油的熏蒸作用效果顯著,具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的價(jià)值,其對(duì)雜擬谷盜成蟲處理24h、48h、72h后的LC_(50)分別為7.45mg/L、7.09mg/L和6.37 mg/L,對(duì)玉米象成蟲處理24h、48h、72h后的LC_(50)分別為8.42mg/L、7.70mg/L和6.78mg/L�？梢�(jiàn)互葉白千層精油應(yīng)用于儲(chǔ)糧害蟲的防治具有可行性。2、互葉白千層精油的殺蟲活性成分分析利用GC-MS技術(shù)對(duì)互葉白千層精油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,并以峰面積歸一化法測(cè)定各成分的相對(duì)含量。GC-MS主要鑒定出10種主要成分,分別是α-蒎烯(α-pinene)、檜烯(sabinene)、α-松油烯(α-terpinene)、對(duì)傘花烴(p-cymene)、傜烯(limonene)、1,8-桉葉油素(1,8-cineole)、γ-松油烯(γ-terpinene)、異松油烯(terpinolene)、4-松油醇(terpinen-4-ol)和α-松油醇(α-terpineol)。定量分析表明互葉白千層精油的主要成分多為萜類化合物,其中4-松油醇的含量高達(dá)40.09%,說(shuō)明該精油為4-松油醇型。根據(jù)GC-MS分析結(jié)果,實(shí)驗(yàn)選取其中含量較高的五種成分進(jìn)行活性研究。結(jié)果顯示各成分均具有良好的熏蒸毒力,其熏蒸毒力大小為:4-松油醇α-松油醇1,8-桉葉油素γ-松油烯α-松油烯。其中4-松油醇和α-松油醇熏蒸效果顯著,尤其4-松油醇熏蒸效果突出,其對(duì)雜擬谷盜和玉米象熏蒸作用的LC_(50)分別為3.22mg/L和3.83mg/l,具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為儲(chǔ)糧害蟲熏蒸劑的潛能。3、互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲熏蒸作用生化機(jī)理的探討采用三角瓶熏蒸法處理試蟲后測(cè)定其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(ache)、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)和羧酸酯酶(care)酶的活性,旨在從生化水平探討互葉白千層精油對(duì)試蟲熏蒸作用的機(jī)理。結(jié)果表明:分別用雜擬谷盜和玉米象的致死中濃度(7.45mg/l、8.42mg/l)熏蒸處理24h后,兩種儲(chǔ)糧害蟲體內(nèi)ache、gst和care酶活力均受到抑制,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),三種酶活力都有一定程度的恢復(fù)趨勢(shì),雖有些波動(dòng),但整體均顯著低于對(duì)照的酶活力;而在熏蒸12h時(shí),玉米象體內(nèi)care酶活力受到互葉白千層精油脅迫而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。低濃度處理(5.39mg/l)24h后,雜擬谷盜體內(nèi)gst酶和玉米象體內(nèi)care酶活力受到互葉白千層精油脅迫而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),玉米象體內(nèi)ache活力與空白對(duì)照組ache的酶活力基本相同,表現(xiàn)出對(duì)ache的酶活力無(wú)影響,而隨著處理劑量的升高,抑制作用增加;其中玉米象的care酶活力在7.48mg/l濃度精油熏蒸下產(chǎn)生了一定的應(yīng)激反應(yīng),但仍然顯著低于對(duì)照,表現(xiàn)出抑制作用。4、互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲熏蒸作用的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析使用illuminahiseq平臺(tái)首次對(duì)雜擬谷盜和玉米象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分別獲得雜擬谷盜(8.96gb)和玉米象(8.93gb)的原始數(shù)據(jù)。其中,雜擬谷盜對(duì)照組和處理組分別獲得45,114,010和44,228,536cleanreads,玉米象對(duì)照組和處理組分別獲得44,697,706和44,884,212cleanreads。經(jīng)trinity軟件組裝最終分別獲得28,885和33,483個(gè)unigene,平均長(zhǎng)度分別為944nt和1,280nt。通過(guò)將unigene分別比對(duì)到nr、nt、swissprot、cog、kegg、go和interpro等七大蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋,分別共有23,571(81.60%)、20,811(62.15%)條unigene獲得功能注釋。通過(guò)比較處理組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分別發(fā)現(xiàn)2,208和3,562個(gè)差異表達(dá)基因,其中雜擬谷盜有999個(gè)基因上調(diào),1,209個(gè)基因下調(diào);玉米象有2,836個(gè)基因上調(diào),726個(gè)基因下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,包括go分析和keggpathway富集分析,結(jié)果顯示:go功能分析中,unigenes主要被分類到細(xì)胞組分(cellularcomponent)、分子功能(molecularfunction)和生物學(xué)過(guò)程(biologicalprocess)三大類的47類詳細(xì)go功能類別中。pathway功能分析中,雜擬谷盜有18,074條unigene被均注釋到42條kegg代謝通路中。獲得1,751條pathway的富集數(shù)據(jù),其中顯著性富集(qvalue≤0.05,pvalue≤0.05)的pathway有23條。在玉米象轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中,有15,074、18,074條unigene被注釋到42條kegg代謝通路中,獲得2,456條pathway的富集數(shù)據(jù)。其中顯著性富集的pathway有15條。根據(jù)go和pathway代謝通路富集分析預(yù)測(cè)和確定了顯著性富集的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,包括線粒體電子傳遞、代謝途徑、甾類激素的生物合成和神經(jīng)遞質(zhì)代謝等信號(hào)通路。結(jié)果表明互葉白千層精油的作用靶標(biāo)可能是呼吸鏈,此外解毒代謝酶細(xì)胞色素p450、羧酸酯酶和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶參與了降解、代謝互葉白千層精油的化學(xué)成分等反應(yīng)。對(duì)雜擬谷盜和玉米象進(jìn)行qrt-pcr內(nèi)參基因選擇。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選15個(gè)上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)基因,并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdh)為內(nèi)參基因,采用ΔΔct法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:定量pcr測(cè)定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。5、互葉白千層精油安全性的初步評(píng)價(jià)對(duì)互葉白千層精油進(jìn)行大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮、吸入和家兔眼刺激、皮膚刺激及豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)等的毒性試驗(yàn),對(duì)其安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中,互葉白千層精油對(duì)大鼠急性經(jīng)口LD_(50)雌性為1710mg/kgb.wt.,雄性為1470mg/kgb.wt.,均屬低等毒類。急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)中,互葉白千層精油對(duì)大鼠對(duì)大鼠急性經(jīng)皮LD_(50)雌性為3160mg/kgb.wt.、雄性為4300mg/kgb.wt.,均屬低等毒類。急性吸入毒性試驗(yàn)中,互葉白千層精油對(duì)大鼠的急性吸入LC_(50)(2h)雌、雄性均大于5000mg/m~3,屬微毒類。急性皮膚刺激試驗(yàn)中,互葉白千層精油對(duì)大鼠家兔皮膚刺激反應(yīng)積分為2.5,7天恢復(fù)正常,屬中等刺激性。急性眼刺激試驗(yàn)中,互葉白千層精油對(duì)家兔未沖洗時(shí)急性眼刺激積分指數(shù)為7.5,平均指數(shù)為1.0(4天后小于5),7天恢復(fù)正常,屬輕度至中度刺激性;4s沖洗時(shí)急性眼刺激積分指數(shù)為4.0,平均指數(shù)為0.0(48小時(shí)后為0),48小時(shí)恢復(fù)正常,屬無(wú)刺激性;30s沖洗時(shí)急性眼刺激積分指數(shù)為4.0,平均指數(shù)為2.5(48小時(shí)后小于5),72小時(shí)恢復(fù)正常,屬輕度刺激性。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中,互葉白千層精油對(duì)豚鼠致敏率為66.67%,具有一定的致敏性。根據(jù)以上結(jié)果,認(rèn)為互葉白千層精油急性毒性低,該物質(zhì)安全性良好,可對(duì)其進(jìn)行下一階段的遺傳毒性試驗(yàn)。6、互葉白千層精油防治儲(chǔ)糧害蟲的實(shí)倉(cāng)模擬試驗(yàn)在小麥模擬實(shí)倉(cāng)試驗(yàn)中,互葉白千層精油分別設(shè)置了不同的濃度梯度和時(shí)間梯度測(cè)試,測(cè)試了其對(duì)雜擬谷盜和玉米象的實(shí)倉(cāng)殺蟲效果。實(shí)倉(cāng)模擬試驗(yàn)結(jié)果顯示:在28℃、20d黑暗條件下,互葉白千層精油對(duì)上層的雜擬谷盜和玉米象均具有良好的實(shí)倉(cāng)熏蒸效果,對(duì)下層兩種害蟲的熏蒸效果一般。使用劑量為598.50mg/l時(shí),上層和下層小麥中雜擬谷盜的死亡率分別為68.34%、40.00%,其熏蒸作用的LC_(50)分別為373.45mg/l、748.66mg/l;上層和下層小麥中玉米象的死亡率分別為90.00%、51.67%,其熏蒸作用的LC_(50)分別為290.35mg/l、566.80mg/l。在28℃黑暗條件下,使用598.50mg/l的劑量分別密閉熏蒸1d、7d、14d和20d后,其實(shí)倉(cāng)熏蒸效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng),14d后對(duì)雜擬谷盜和玉米象上層的熏蒸毒力分別為52.34%和72.67%,下層分別為31.67%和42.34%,與20d后對(duì)兩種害蟲的熏蒸毒力差異不明顯。小麥對(duì)互葉白千層精油具有一定的吸附性,在實(shí)際應(yīng)用中要結(jié)合糧食種類、糧倉(cāng)堆積的高度合理用藥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S379.5

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本文編號(hào)：2384767