【摘要】：本研究采用營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)技術(shù)與方法,借助細(xì)胞培養(yǎng)、同位素示蹤及活體注射等手段,較為系統(tǒng)地研究了尼羅羅非魚(yú)過(guò)氧化物體增殖激活受體(PPARα)的結(jié)構(gòu)、組織分布、激活機(jī)制及其對(duì)脂分解代謝的調(diào)控作用,較全面地分析了羅非魚(yú)PPARα調(diào)控脂代謝的原理及主要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先克隆了羅非魚(yú)PPARα基因,分析了該基因的分子結(jié)構(gòu)和功能。之后,利用PPARα的通用配體非諾貝特(Fenofibrate)和饑餓應(yīng)激,在活體和細(xì)胞水平對(duì)羅非魚(yú)PPARα的激活機(jī)制進(jìn)行了確認(rèn),同時(shí)詳細(xì)闡明了羅非魚(yú)PPARα激活后對(duì)脂代謝的系統(tǒng)性調(diào)控機(jī)制。為探討生理和營(yíng)養(yǎng)背景是否會(huì)影響羅非魚(yú)PPARα的激活和脂代謝調(diào)控效能,本文又通過(guò)對(duì)飼料脂肪含量的調(diào)節(jié)和長(zhǎng)期投喂,首先構(gòu)建高低體脂含量的羅非魚(yú)模型,再在此生理和營(yíng)養(yǎng)背景下添加PPARα配體Fenofibrtate飼喂4周,研究不同體脂和營(yíng)養(yǎng)背景下羅非魚(yú)PPARα的激活和降脂效能。最后,為進(jìn)一步驗(yàn)證羅非魚(yú)PPARα有效激活所需的營(yíng)養(yǎng)學(xué)背景,并同時(shí)探索PPARα激活后的降脂效能是否能促進(jìn)脂肪供能從而節(jié)約飼料蛋白,本文進(jìn)一步采用不同蛋白脂肪水平配比飼料飼喂羅非魚(yú)8周,研究了飼料蛋白脂肪配比對(duì)Fenofibrate激活羅非魚(yú)PPARα調(diào)控脂代謝促生長(zhǎng)效應(yīng)的影響,以期了解羅非魚(yú)PPARα激活促進(jìn)脂肪分解提高飼料蛋白質(zhì)利用效率的適宜飼料營(yíng)養(yǎng)配比,為解決當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚(yú)類(lèi)脂肪沉積過(guò)度提供理論依據(jù)。本文主要的研究結(jié)果和結(jié)論如下：1. PPARα的基因克隆和表達(dá)高等哺乳動(dòng)物中,過(guò)氧化物體增殖激活受體α(PPARα)已被證實(shí)作為脂類(lèi)分解代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子并已得到廣泛研究。然而,在魚(yú)類(lèi)中,PPARα影響調(diào)控脂代謝的情況及相關(guān)機(jī)制卻仍不明了。為探究PPARα基因在尼羅羅非魚(yú)脂肪分解代謝中的調(diào)控機(jī)制,本工作首先克隆得到了尼羅羅非魚(yú)PPARα(NtPPARα)基因的全長(zhǎng)序列,研究了NtPPARα基因的組織特異性表達(dá),以期窺探相關(guān)的分子營(yíng)養(yǎng)機(jī)制。結(jié)果表明,尼羅羅非魚(yú)PPARa cDNA全長(zhǎng)1686bp,包括167bp的5’端非翻譯區(qū)(5'UTR),91bp的3’端非翻譯區(qū)(3'UTR),開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)1428bp,編碼475個(gè)氨基酸(GenBank accession No. AHI50297),預(yù)測(cè)分子量約為52.98 kDa,理論等電點(diǎn)為5.87。SWISS-MODEL模擬的PPARα三維結(jié)構(gòu)顯示該蛋白質(zhì)有16個(gè)α螺旋和3條空間平行的p折疊,以及一些伸展片段和無(wú)規(guī)則卷曲等。作為核蛋白,其不存在信號(hào)肽,但含有典型的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域。與所比對(duì)的物種相比,PPARα氨基酸同源性均在63%以上,相似性中度同源,如與非洲爪蟾相似性63.7%,斑馬魚(yú)67.6%,小鼠64.5%,人64.7%。但在DBD結(jié)構(gòu)域上,則顯示出高度的同源性,如與非洲爪蟾相似性90.6%,斑馬魚(yú)90.6%,小鼠89.4%,人89.4%。不過(guò)值得注意的是在PPARα預(yù)測(cè)LBD結(jié)構(gòu)域區(qū),羅非魚(yú)比同源的人和老鼠多出18個(gè)氨基酸(252-269),這一現(xiàn)象也發(fā)生在斑馬魚(yú)、草魚(yú)和虹鱒上,分別多出6、2和2個(gè)氨基酸。由于LBD是PPARα激活必需的配基結(jié)合區(qū),這一區(qū)域的氨基酸變異或許預(yù)示羅非魚(yú)PPARα在激活機(jī)制上將與高等哺乳動(dòng)物存在差異。進(jìn)化樹(shù)分析顯示,NtPPARα與金頭鯛親緣關(guān)系最近,而與人最遠(yuǎn)。組織特異性表達(dá)研究表明,羅非魚(yú)PPARα基因在腦、心、肝臟中表達(dá)最高,紅肌、腎、皮膚、脂肪組織、鰓和白肌次之,在脾臟中表達(dá)最低。這與高等動(dòng)物上PPARα主要分布在脂肪酸分解代謝較強(qiáng)的肝臟、心、腦、骨骼肌等相一致。2.羅非魚(yú)PPARα激活機(jī)制及激活后對(duì)脂代謝的系統(tǒng)性調(diào)控功能為驗(yàn)證PPARα在羅非魚(yú)細(xì)胞水平和活體水平上的激活機(jī)制,本部分工作采用PPARα通用配體Fenofibrate對(duì)羅非魚(yú)肝臟原代細(xì)胞和活體進(jìn)行分別處理,研究其對(duì)羅非魚(yú)PPARα的激活情況,并隨后進(jìn)一步研究羅非魚(yú)PPARα被激活后對(duì)脂代謝的系統(tǒng)性調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先將密度為106ml-16孔板肝原代細(xì)胞培養(yǎng)12h貼壁后,在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加200nM Fenofibrate或進(jìn)行血清饑餓處理,然后在12h和24h分別對(duì)細(xì)胞采樣,以測(cè)定細(xì)胞PPARα在mRNA、蛋白和蛋白磷酸化水平上的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：兩種處理12h后PPARα在各水平上均無(wú)顯著變化,但在Fenofibrate處理24h后,PPARa的mRNA表達(dá)水平顯著升高。此外,在兩處理作用24h后,PPARa蛋白表達(dá)水平顯著增加,同時(shí)蛋白去磷酸化水平也有顯著增加。為此我們可首先推斷魚(yú)類(lèi)PPARa可像哺乳動(dòng)物一樣被激活,但不同激活方式、激活時(shí)間會(huì)在mRNA、蛋白和蛋白磷酸化水平上存在激活效應(yīng)的差異。在活體實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)初始體重為11.83±0.11 g的魚(yú)進(jìn)行高脂飼喂、高脂飼喂+fenofibrate、4周饑餓三種處理,養(yǎng)殖4周,以期通過(guò)外源性藥物和自然饑餓降脂兩種方式來(lái)研究羅非魚(yú)PPARα在活體狀態(tài)下的激活和激活后的脂代謝調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示：4周后,Fenofibrate和饑餓處理對(duì)羅非魚(yú)均呈現(xiàn)明顯的降肝臟脂效應(yīng),饑餓處理下降脂效果最為明顯。Fenofibrate處理下,PPARα在mRNA和蛋白水平均沒(méi)有明顯變化,但是PPARα蛋白磷酸化呈現(xiàn)顯著降低。而在饑餓處理下,PPARα在mRNA、蛋白和蛋白去磷酸化水平均有明顯的上調(diào)效應(yīng)。同時(shí),通過(guò)羅非魚(yú)活體注射標(biāo)記脂肪酸后的分解率測(cè)定、線粒體和過(guò)氧化物酶體脂肪酸β-氧化分解率測(cè)定和線粒體數(shù)目的測(cè)定,我們也發(fā)現(xiàn)PPARα激活后的降肝臟脂肪作用主要是通過(guò)對(duì)線粒體脂肪酸β-氧化分解率的提升和線粒體數(shù)目的增加來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外,PPARα的激活也可促進(jìn)糖異生作用的增強(qiáng)。綜上所述,本工作表明：1) PPARα在蛋白層面的去磷酸化修飾是羅非魚(yú)PPARα激活的基本機(jī)制,只有當(dāng)激活效應(yīng)足夠強(qiáng)時(shí),才能通過(guò)上調(diào)PPARα的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平作為進(jìn)一步的補(bǔ)充機(jī)制；2)羅非魚(yú)PPARα激活后的靶標(biāo)調(diào)控組織是肝臟,且調(diào)控活性較弱,低于嚙齒類(lèi)動(dòng)物；3)PPARα激活降脂的代謝調(diào)控主要是通過(guò)線粒體數(shù)量增殖、提升線粒體脂肪酸p-氧化效率來(lái)實(shí)現(xiàn)4)PPARα激活后會(huì)引起能量代謝通路的系統(tǒng)性變化,尤其影響糖代謝,使糖異生活性增加。這一工作也是國(guó)際上對(duì)魚(yú)類(lèi)PPARα激活和代謝調(diào)控機(jī)制的首次闡述。3.羅非魚(yú)不同體脂和飼料脂肪水平對(duì)Fenofibrate所誘導(dǎo)的PPARa激活及脂代謝調(diào)控活性的影響在前一部分工作獲知了羅非魚(yú)PPARa的激活機(jī)制和對(duì)脂代謝的基本調(diào)控活性后,本部分工作通過(guò)兩個(gè)階段的實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探討PPARa的激活和對(duì)脂代謝的調(diào)控活性是否也受到魚(yú)體自身體脂含量和飼料脂肪含量的影響。本部分工作首先構(gòu)建了高低體脂含量的羅非魚(yú)模型,之后再進(jìn)行Fenofibrate誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。在第一階段的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)初始體重為2.24±0.04 g的羅非魚(yú)分別飼喂酪蛋白和明膠為主要蛋白源,豆油為脂肪源的純化飼料,配制成蛋白水平43%,脂肪水平分別為1%和13%的兩組高低脂肪飼料,進(jìn)行10周養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,高脂飼料投喂下羅非魚(yú)增重率(WGR)和肝體比(HSI),以及肌肉、肝臟和脂肪組織中的甘油三酯均無(wú)顯著變化,但是高脂飼喂組其脂體比(MFI)和脂肪組織重量顯著高于低脂飼料組,形成兩組體脂含量顯著不同的實(shí)驗(yàn)魚(yú)。血清生化指標(biāo)顯示,兩飼料組除高脂肪組丙二醛(MDA)顯著升高外,其它檢測(cè)指標(biāo)差異均不顯著。熒光定量結(jié)果顯示,高脂投喂水平下,脂肪組織脂肪水解相關(guān)基因甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)與脂肪合成相關(guān)基因類(lèi)固醇合成元件結(jié)合蛋白(SREBP1c)均極髭著高于低脂飼喂,而其它所有檢測(cè)組織FABP4均顯著下調(diào),肝臟炎癥相關(guān)基因TGF1β顯著上調(diào)。尤其重要的是,這一階段的結(jié)果表明,單純的高脂飼料投喂并不能上調(diào)PPARα和其調(diào)控的脂分解基因的表達(dá)。為研究不同體脂沉積背景結(jié)合飼料脂肪水平對(duì)Fenofibrate激活PPARα降脂效應(yīng)的影響,第二階段的實(shí)驗(yàn)采用前一階段所得不同體脂含量的羅非魚(yú)為研究對(duì)象,采用在原飼料基礎(chǔ)上分別添加與不添加Fenofibrate的處理,進(jìn)行為期4周的養(yǎng)殖。結(jié)果顯示,高低飼料脂肪飼喂背景下,羅非魚(yú)增重率(WGR)和脂體比(MFI)以及肌肉、脂肪組織中的甘油三酯均無(wú)顯著變化,但是高脂肪飼料飼喂組其肝體比(HSI)和甘油三酯(TG)水平顯著降低。血清生化指標(biāo)顯示,兩飼料組除高脂肪組甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)顯著降低與高密度脂蛋白(HDL)顯著升高外,其它指標(biāo)兩處理組間差異均不顯著。體外β-氧化和線粒體標(biāo)志酶MAO測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示,高低脂飼料飼喂組的肝臟氧化分解率與酶活性均顯著升高,而肌肉和脂肪組織影響不大。而mRNA表達(dá)和蛋白印跡測(cè)定結(jié)果顯示,藥物處理后,肝臟PPARα mRNA和蛋白水平均在高脂肪飼料飼喂組顯著升高,但在低脂飼料組無(wú)顯著差異。其它脂代謝相關(guān)基因的檢測(cè)顯示,在高脂飼料投喂下,Fenofibrate處理會(huì)促發(fā)FABP4顯著上調(diào),TGF1β顯著下調(diào),肌肉組織CPT1α和CPTlb均顯著上調(diào),脂肪組織影響不大；而在低脂飼料組,Fenofibrate處理則使得肌肉PPARα的表達(dá)反而顯著下調(diào),脂肪組織ATGL顯著上調(diào),而肝臟無(wú)影響。綜上所述,本研究表明：1)單純的高脂攝入不能激活羅非魚(yú)的組織PPARa表達(dá);2)高脂飼料飼喂?fàn)顟B(tài)下,羅非魚(yú)呈現(xiàn)一定程度的炎癥與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；3)Fenofibrate激活羅非魚(yú)PPARa調(diào)控降脂與營(yíng)養(yǎng)背景密切相關(guān),其對(duì)脂肪分解代謝的調(diào)控作用在高脂攝入狀態(tài)下更為明顯；4)肝臟是PPARa調(diào)控主要靶組織；5) Fenofibrate處理可以有效降低高脂飼料投喂下羅非魚(yú)的肝臟脂含量,并可能同時(shí)存在對(duì)炎癥的緩解效應(yīng)。4.飼料中不同蛋白/脂肪配比對(duì)Fenofibrate所誘導(dǎo)的羅非魚(yú)PPARa激活及脂代謝調(diào)控活性的影響在了解飼料脂肪水平可以影響Fenofibrate所誘導(dǎo)的PPARa激活及脂代謝調(diào)控活性后,為更全面地探討其它營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)羅非魚(yú)PPARa激活及脂代謝調(diào)控活性的影響,并驗(yàn)證PPARa激活所導(dǎo)致的降脂效果是否可以起到節(jié)約飼料蛋白質(zhì)并促進(jìn)生長(zhǎng)的作用,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討了在不同蛋白/脂肪配比情況下,Fenofibrate所誘導(dǎo)的羅非魚(yú)PPARa激活及其對(duì)脂代謝調(diào)控活性的差異。本實(shí)驗(yàn)以丹麥白魚(yú)粉、大豆粉為主要蛋白源,設(shè)二蛋白水平28%和38%(低蛋白和高蛋白)；豆油(SO)、魚(yú)油(FO)為主要脂肪源,設(shè)二脂肪水平7%和14%(中脂肪和高脂肪),共配制成4種基礎(chǔ)飼料。同時(shí),通過(guò)在基礎(chǔ)飼料上添加或不添加Fenofibrate,從而配制成4組加藥飼料(Fenofibrate)和4組不加藥的對(duì)照飼料。本實(shí)驗(yàn)使用480尾初始體重為8.0±0.10 g的羅非魚(yú),隨機(jī)均分至24個(gè)桶連成的循環(huán)系統(tǒng),每組飼料設(shè)3個(gè)平行,進(jìn)行為期8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,各飼料組的水分和蛋白含量均沒(méi)有顯著差異。28%飼料蛋白水平下藥物組的增重率、蛋白質(zhì)效率顯著低于對(duì)照組,而餌料系數(shù)、肝體比要顯著高于對(duì)照組。藥物處理降低了所有組血清中的低密度脂蛋白(LDL),所有高脂肪水平組的高密度脂蛋白(HDL),以及低蛋白中脂肪水平組的血清總氨基酸(AA)和血氨(NH4),但低蛋白中脂肪水平組的血清甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)水平在藥物后有顯著升高。藥物處理后,高蛋白中脂肪組脂肪分解與合成相關(guān)基因分別呈現(xiàn)顯著上調(diào)(CPT1a、ALCY、FAS、 GPAT)和下調(diào)(ACO、DGAT2),脂蛋白相關(guān)基因呈現(xiàn)顯著下調(diào)(LDLR、MTP、 ApoB),其余各組基因相對(duì)變化較小。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1)在以魚(yú)粉、豆粕為主要蛋白源的半純化飼料中,使用Fenofibrate作為降脂激活劑所起到的明顯的降肝臟脂肪效應(yīng)與飼料蛋白含量呈正相關(guān),高飼料蛋白下Fenofibrate的降脂效果更為明顯；2) Fenofibrate在高蛋白中脂肪水平有一定的降脂促生長(zhǎng)趨勢(shì)外,其余均沒(méi)有明顯的起到降脂促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng)的效應(yīng)。相反,藥物處理還抑制了低蛋白組羅非魚(yú)的生長(zhǎng),并在低蛋白中脂肪水平導(dǎo)致肝臟代謝功能受損和并產(chǎn)生過(guò)氧化應(yīng)激。綜上所述,Fenofibrate所誘導(dǎo)的羅非魚(yú)PPARα激活及其脂代謝調(diào)控活性與飼料蛋白水平和蛋白脂肪配比密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
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本文編號(hào)：2368806