【摘要】：本研究采用營養(yǎng)學、生物化學、分子生物學及轉錄組學相關技術與方法,借助細胞培養(yǎng)、同位素示蹤及活體注射等手段,較為系統(tǒng)地研究了尼羅羅非魚過氧化物體增殖激活受體(PPARα)的結構、組織分布、激活機制及其對脂分解代謝的調控作用,較全面地分析了羅非魚PPARα調控脂代謝的原理及主要靶點。本實驗首先克隆了羅非魚PPARα基因,分析了該基因的分子結構和功能。之后,利用PPARα的通用配體非諾貝特(Fenofibrate)和饑餓應激,在活體和細胞水平對羅非魚PPARα的激活機制進行了確認,同時詳細闡明了羅非魚PPARα激活后對脂代謝的系統(tǒng)性調控機制。為探討生理和營養(yǎng)背景是否會影響羅非魚PPARα的激活和脂代謝調控效能,本文又通過對飼料脂肪含量的調節(jié)和長期投喂,首先構建高低體脂含量的羅非魚模型,再在此生理和營養(yǎng)背景下添加PPARα配體Fenofibrtate飼喂4周,研究不同體脂和營養(yǎng)背景下羅非魚PPARα的激活和降脂效能。最后,為進一步驗證羅非魚PPARα有效激活所需的營養(yǎng)學背景,并同時探索PPARα激活后的降脂效能是否能促進脂肪供能從而節(jié)約飼料蛋白,本文進一步采用不同蛋白脂肪水平配比飼料飼喂羅非魚8周,研究了飼料蛋白脂肪配比對Fenofibrate激活羅非魚PPARα調控脂代謝促生長效應的影響,以期了解羅非魚PPARα激活促進脂肪分解提高飼料蛋白質利用效率的適宜飼料營養(yǎng)配比,為解決當前水產養(yǎng)殖中魚類脂肪沉積過度提供理論依據。本文主要的研究結果和結論如下：1. PPARα的基因克隆和表達高等哺乳動物中,過氧化物體增殖激活受體α(PPARα)已被證實作為脂類分解代謝的關鍵調控因子并已得到廣泛研究。然而,在魚類中,PPARα影響調控脂代謝的情況及相關機制卻仍不明了。為探究PPARα基因在尼羅羅非魚脂肪分解代謝中的調控機制,本工作首先克隆得到了尼羅羅非魚PPARα(NtPPARα)基因的全長序列,研究了NtPPARα基因的組織特異性表達,以期窺探相關的分子營養(yǎng)機制。結果表明,尼羅羅非魚PPARa cDNA全長1686bp,包括167bp的5’端非翻譯區(qū)(5'UTR),91bp的3’端非翻譯區(qū)(3'UTR),開放閱讀框(ORF)全長1428bp,編碼475個氨基酸(GenBank accession No. AHI50297),預測分子量約為52.98 kDa,理論等電點為5.87。SWISS-MODEL模擬的PPARα三維結構顯示該蛋白質有16個α螺旋和3條空間平行的p折疊,以及一些伸展片段和無規(guī)則卷曲等。作為核蛋白,其不存在信號肽,但含有典型的DBD和LBD結構域。與所比對的物種相比,PPARα氨基酸同源性均在63%以上,相似性中度同源,如與非洲爪蟾相似性63.7%,斑馬魚67.6%,小鼠64.5%,人64.7%。但在DBD結構域上,則顯示出高度的同源性,如與非洲爪蟾相似性90.6%,斑馬魚90.6%,小鼠89.4%,人89.4%。不過值得注意的是在PPARα預測LBD結構域區(qū),羅非魚比同源的人和老鼠多出18個氨基酸(252-269),這一現象也發(fā)生在斑馬魚、草魚和虹鱒上,分別多出6、2和2個氨基酸。由于LBD是PPARα激活必需的配基結合區(qū),這一區(qū)域的氨基酸變異或許預示羅非魚PPARα在激活機制上將與高等哺乳動物存在差異。進化樹分析顯示,NtPPARα與金頭鯛親緣關系最近,而與人最遠。組織特異性表達研究表明,羅非魚PPARα基因在腦、心、肝臟中表達最高,紅肌、腎、皮膚、脂肪組織、鰓和白肌次之,在脾臟中表達最低。這與高等動物上PPARα主要分布在脂肪酸分解代謝較強的肝臟、心、腦、骨骼肌等相一致。2.羅非魚PPARα激活機制及激活后對脂代謝的系統(tǒng)性調控功能為驗證PPARα在羅非魚細胞水平和活體水平上的激活機制,本部分工作采用PPARα通用配體Fenofibrate對羅非魚肝臟原代細胞和活體進行分別處理,研究其對羅非魚PPARα的激活情況,并隨后進一步研究羅非魚PPARα被激活后對脂代謝的系統(tǒng)性調控機制。本實驗首先將密度為106ml-16孔板肝原代細胞培養(yǎng)12h貼壁后,在細胞培養(yǎng)液中添加200nM Fenofibrate或進行血清饑餓處理,然后在12h和24h分別對細胞采樣,以測定細胞PPARα在mRNA、蛋白和蛋白磷酸化水平上的表達變化。結果顯示：兩種處理12h后PPARα在各水平上均無顯著變化,但在Fenofibrate處理24h后,PPARa的mRNA表達水平顯著升高。此外,在兩處理作用24h后,PPARa蛋白表達水平顯著增加,同時蛋白去磷酸化水平也有顯著增加。為此我們可首先推斷魚類PPARa可像哺乳動物一樣被激活,但不同激活方式、激活時間會在mRNA、蛋白和蛋白磷酸化水平上存在激活效應的差異。在活體實驗中,我們對初始體重為11.83±0.11 g的魚進行高脂飼喂、高脂飼喂+fenofibrate、4周饑餓三種處理,養(yǎng)殖4周,以期通過外源性藥物和自然饑餓降脂兩種方式來研究羅非魚PPARα在活體狀態(tài)下的激活和激活后的脂代謝調控機制。結果顯示：4周后,Fenofibrate和饑餓處理對羅非魚均呈現明顯的降肝臟脂效應,饑餓處理下降脂效果最為明顯。Fenofibrate處理下,PPARα在mRNA和蛋白水平均沒有明顯變化,但是PPARα蛋白磷酸化呈現顯著降低。而在饑餓處理下,PPARα在mRNA、蛋白和蛋白去磷酸化水平均有明顯的上調效應。同時,通過羅非魚活體注射標記脂肪酸后的分解率測定、線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β-氧化分解率測定和線粒體數目的測定,我們也發(fā)現PPARα激活后的降肝臟脂肪作用主要是通過對線粒體脂肪酸β-氧化分解率的提升和線粒體數目的增加來實現的。此外,PPARα的激活也可促進糖異生作用的增強。綜上所述,本工作表明：1) PPARα在蛋白層面的去磷酸化修飾是羅非魚PPARα激活的基本機制,只有當激活效應足夠強時,才能通過上調PPARα的轉錄水平和蛋白表達水平作為進一步的補充機制；2)羅非魚PPARα激活后的靶標調控組織是肝臟,且調控活性較弱,低于嚙齒類動物；3)PPARα激活降脂的代謝調控主要是通過線粒體數量增殖、提升線粒體脂肪酸p-氧化效率來實現4)PPARα激活后會引起能量代謝通路的系統(tǒng)性變化,尤其影響糖代謝,使糖異生活性增加。這一工作也是國際上對魚類PPARα激活和代謝調控機制的首次闡述。3.羅非魚不同體脂和飼料脂肪水平對Fenofibrate所誘導的PPARa激活及脂代謝調控活性的影響在前一部分工作獲知了羅非魚PPARa的激活機制和對脂代謝的基本調控活性后,本部分工作通過兩個階段的實驗,進一步探討PPARa的激活和對脂代謝的調控活性是否也受到魚體自身體脂含量和飼料脂肪含量的影響。本部分工作首先構建了高低體脂含量的羅非魚模型,之后再進行Fenofibrate誘導實驗。在第一階段的實驗中,對初始體重為2.24±0.04 g的羅非魚分別飼喂酪蛋白和明膠為主要蛋白源,豆油為脂肪源的純化飼料,配制成蛋白水平43%,脂肪水平分別為1%和13%的兩組高低脂肪飼料,進行10周養(yǎng)殖實驗。從本實驗結果可知,高脂飼料投喂下羅非魚增重率(WGR)和肝體比(HSI),以及肌肉、肝臟和脂肪組織中的甘油三酯均無顯著變化,但是高脂飼喂組其脂體比(MFI)和脂肪組織重量顯著高于低脂飼料組,形成兩組體脂含量顯著不同的實驗魚。血清生化指標顯示,兩飼料組除高脂肪組丙二醛(MDA)顯著升高外,其它檢測指標差異均不顯著。熒光定量結果顯示,高脂投喂水平下,脂肪組織脂肪水解相關基因甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)與脂肪合成相關基因類固醇合成元件結合蛋白(SREBP1c)均極髭著高于低脂飼喂,而其它所有檢測組織FABP4均顯著下調,肝臟炎癥相關基因TGF1β顯著上調。尤其重要的是,這一階段的結果表明,單純的高脂飼料投喂并不能上調PPARα和其調控的脂分解基因的表達。為研究不同體脂沉積背景結合飼料脂肪水平對Fenofibrate激活PPARα降脂效應的影響,第二階段的實驗采用前一階段所得不同體脂含量的羅非魚為研究對象,采用在原飼料基礎上分別添加與不添加Fenofibrate的處理,進行為期4周的養(yǎng)殖。結果顯示,高低飼料脂肪飼喂背景下,羅非魚增重率(WGR)和脂體比(MFI)以及肌肉、脂肪組織中的甘油三酯均無顯著變化,但是高脂肪飼料飼喂組其肝體比(HSI)和甘油三酯(TG)水平顯著降低。血清生化指標顯示,兩飼料組除高脂肪組甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)顯著降低與高密度脂蛋白(HDL)顯著升高外,其它指標兩處理組間差異均不顯著。體外β-氧化和線粒體標志酶MAO測定實驗顯示,高低脂飼料飼喂組的肝臟氧化分解率與酶活性均顯著升高,而肌肉和脂肪組織影響不大。而mRNA表達和蛋白印跡測定結果顯示,藥物處理后,肝臟PPARα mRNA和蛋白水平均在高脂肪飼料飼喂組顯著升高,但在低脂飼料組無顯著差異。其它脂代謝相關基因的檢測顯示,在高脂飼料投喂下,Fenofibrate處理會促發(fā)FABP4顯著上調,TGF1β顯著下調,肌肉組織CPT1α和CPTlb均顯著上調,脂肪組織影響不大；而在低脂飼料組,Fenofibrate處理則使得肌肉PPARα的表達反而顯著下調,脂肪組織ATGL顯著上調,而肝臟無影響。綜上所述,本研究表明：1)單純的高脂攝入不能激活羅非魚的組織PPARa表達;2)高脂飼料飼喂狀態(tài)下,羅非魚呈現一定程度的炎癥與脂質過氧化反應；3)Fenofibrate激活羅非魚PPARa調控降脂與營養(yǎng)背景密切相關,其對脂肪分解代謝的調控作用在高脂攝入狀態(tài)下更為明顯；4)肝臟是PPARa調控主要靶組織；5) Fenofibrate處理可以有效降低高脂飼料投喂下羅非魚的肝臟脂含量,并可能同時存在對炎癥的緩解效應。4.飼料中不同蛋白/脂肪配比對Fenofibrate所誘導的羅非魚PPARa激活及脂代謝調控活性的影響在了解飼料脂肪水平可以影響Fenofibrate所誘導的PPARa激活及脂代謝調控活性后,為更全面地探討其它營養(yǎng)因素對羅非魚PPARa激活及脂代謝調控活性的影響,并驗證PPARa激活所導致的降脂效果是否可以起到節(jié)約飼料蛋白質并促進生長的作用,本實驗重點探討了在不同蛋白/脂肪配比情況下,Fenofibrate所誘導的羅非魚PPARa激活及其對脂代謝調控活性的差異。本實驗以丹麥白魚粉、大豆粉為主要蛋白源,設二蛋白水平28%和38%(低蛋白和高蛋白)；豆油(SO)、魚油(FO)為主要脂肪源,設二脂肪水平7%和14%(中脂肪和高脂肪),共配制成4種基礎飼料。同時,通過在基礎飼料上添加或不添加Fenofibrate,從而配制成4組加藥飼料(Fenofibrate)和4組不加藥的對照飼料。本實驗使用480尾初始體重為8.0±0.10 g的羅非魚,隨機均分至24個桶連成的循環(huán)系統(tǒng),每組飼料設3個平行,進行為期8周的養(yǎng)殖實驗。結果表明,各飼料組的水分和蛋白含量均沒有顯著差異。28%飼料蛋白水平下藥物組的增重率、蛋白質效率顯著低于對照組,而餌料系數、肝體比要顯著高于對照組。藥物處理降低了所有組血清中的低密度脂蛋白(LDL),所有高脂肪水平組的高密度脂蛋白(HDL),以及低蛋白中脂肪水平組的血清總氨基酸(AA)和血氨(NH4),但低蛋白中脂肪水平組的血清甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)水平在藥物后有顯著升高。藥物處理后,高蛋白中脂肪組脂肪分解與合成相關基因分別呈現顯著上調(CPT1a、ALCY、FAS、 GPAT)和下調(ACO、DGAT2),脂蛋白相關基因呈現顯著下調(LDLR、MTP、 ApoB),其余各組基因相對變化較小。以上實驗結果表明,1)在以魚粉、豆粕為主要蛋白源的半純化飼料中,使用Fenofibrate作為降脂激活劑所起到的明顯的降肝臟脂肪效應與飼料蛋白含量呈正相關,高飼料蛋白下Fenofibrate的降脂效果更為明顯；2) Fenofibrate在高蛋白中脂肪水平有一定的降脂促生長趨勢外,其余均沒有明顯的起到降脂促進羅非魚生長的效應。相反,藥物處理還抑制了低蛋白組羅非魚的生長,并在低蛋白中脂肪水平導致肝臟代謝功能受損和并產生過氧化應激。綜上所述,Fenofibrate所誘導的羅非魚PPARα激活及其脂代謝調控活性與飼料蛋白水平和蛋白脂肪配比密切相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
，

本文編號：2368806