【摘要】：花青素苷是使花朵呈色的重要色素之一,其合成與積累過(guò)程與植物發(fā)育和外部環(huán)境條件密切相關(guān),但是目前環(huán)境因子對(duì)花青素苷生物合成調(diào)控的分子機(jī)制尚未得到清楚的解析。光是影響花青素苷生物合成最重要的環(huán)境因子之一,通過(guò)適當(dāng)調(diào)控觀賞植物生長(zhǎng)的光照條件可以顯著提高其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此,解析光照調(diào)控花青素苷生物合成的分子機(jī)制具有理論價(jià)值和實(shí)際意義。菊花(Chrysanthemum xmorifolium Ramat.)是世界著名花卉,花色表型變異十分豐富,其簡(jiǎn)單的色素代謝背景和呈色過(guò)程中對(duì)光照的高度敏感性使其成為研究花青素苷依光合成分子機(jī)制的理想材料。目前對(duì)菊花花青素苷依光合成的研究多集中在表型和生物化學(xué)分析層面,從分子水平上解析光照如何誘導(dǎo)花青素苷生物合成途徑上關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)則較少報(bào)道,并且調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因也尚未被鑒定和分離,限制了通過(guò)調(diào)節(jié)光照條件對(duì)菊花花色進(jìn)行改良的分子育種研究。本研究以對(duì)光照條件高度敏感的紫色系菊花品種‘麗金’為研究材料,對(duì)遮光導(dǎo)致褪色的樣品中的色素成分及含量進(jìn)行對(duì)比分析,并通過(guò)一系列生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析解析了菊花花青素苷依光合成的分子機(jī)制。本研究獲得的主要結(jié)果如下。1.對(duì)‘麗金’的頭狀花序和葉片分別進(jìn)行遮光處理,以正常光照處理和全株遮光分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。花色表型變化的分析結(jié)果表明,3組遮光處理下舌狀花均明顯褪色,且花序遮光處理下的褪色比葉片遮光處理更顯著；色素分析結(jié)果表明,其舌狀花中含有2種矢車菊素衍生物和5種黃酮衍生物,并且3種遮光處理下舌狀花中花青素苷的相對(duì)含量隨花序發(fā)育呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢(shì),下降的顯著程度與花色表型的分析結(jié)果一致。上述結(jié)果說(shuō)明隨花序發(fā)育,光照顯著影響‘麗金’舌狀花中2種矢車菊素苷組分和含量的變化；其頭狀花序和葉片均能響應(yīng)光照并影響花青素苷的生物合成,但花序比葉片的感光能力更強(qiáng)：花序發(fā)育早期是花青素苷生物合成過(guò)程中響應(yīng)光照的關(guān)鍵時(shí)期。2.對(duì)‘麗金’花序發(fā)育的前3個(gè)階段進(jìn)行遮光處理,并以正常光照處理作為對(duì)照組,構(gòu)建了5個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)；通過(guò)RNA序列的從頭組裝獲得了103,517個(gè)特異unigene,其中60,712(58.65%)個(gè)unigene在4個(gè)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了注釋；之后通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出了2,135個(gè)響應(yīng)光照的unigene;代謝通路分析結(jié)果表明,花青素苷代謝通路是唯一的既響應(yīng)光照又與花發(fā)育相關(guān)的完整通路；在遮光條件下,幾乎所有花青素苷生物合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)都被抑制,與舌狀花褪色和花青素苷積累量的下降相吻合；通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),篩選出了4個(gè)參與調(diào)控菊花花青素苷依光合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。依據(jù)這些結(jié)果,推測(cè)花青素苷生物合成途徑上的13個(gè)結(jié)構(gòu)基因家族成員和4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子隨花序發(fā)育的依光表達(dá)可能導(dǎo)致了‘麗金’舌狀花中花青素苷組分和含量發(fā)生變化。3.使用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選出了9個(gè)表達(dá)差異不顯著的候選內(nèi)參基因,之后使用geNorm、NormFinder和qBase plus對(duì)候選基因在不同光照處理下3個(gè)色系的‘麗金’品種中隨花序發(fā)育的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了綜合分析,并用CmF3H基因?qū)?nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)CmF-box和CmPP2A是適用于不同光照處理下基因表達(dá)驗(yàn)證分析的最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。這些結(jié)果為驗(yàn)證17個(gè)候選基因的依光表達(dá)模式提供了最合適的內(nèi)參基因。4.使用上述在不同光照條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,通過(guò)對(duì)比參與調(diào)控菊花花青素苷依光合成的候選結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因以及光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游基因在舌狀花和葉片中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的CmCHS1、CmCHS2、CmF3H、 CmF3'H1、CmF3'H2、 CmF3'H3、CmDFR、CmANS1、CmANS2、CmANS3、Cm3GT、 Cm3MT1、Cm3MT2、CmMYB5-1、CmMYB6、CmMYB7-1和CmbHLH24等17個(gè)基因家族成員的確是參與調(diào)控菊花花青素苷依光合成的關(guān)鍵基因,并且CmHY5的表達(dá)量與花青素苷的含量呈正相關(guān)關(guān)系,而CmPHYA、CmPHYB、CmCRY1a、 CmCRY1b和CmCRY2等5個(gè)光受體基因的表達(dá)與花青素苷的依光合成相關(guān)性較弱；CmCOP1基因的表達(dá)與花青素苷的含量也沒(méi)有明顯的相關(guān)性；此外,大多數(shù)花青素苷生物合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因在舌狀花中特異性表達(dá)。5.在轉(zhuǎn)錄組分析和基因表達(dá)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上,利用iTRAQ技術(shù)從‘麗金’舌狀花中鑒定得到5,106個(gè)原始蛋白,并從中篩選出了45個(gè)遮光后上調(diào)表達(dá)和115個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異蛋白,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)花青素苷生物合成酶在遮光后下調(diào)表達(dá),與編碼基因表達(dá)量的變化和花色表型的分析結(jié)果一致；遮光后,光捕獲葉綠體蛋白的表達(dá)豐度隨花序發(fā)育逐漸上升；通過(guò)功能和通路富集分析,推測(cè)GDSL脂酶可能在菊花花青素苷依光合成的過(guò)程中發(fā)揮作用。這些結(jié)果說(shuō)明花青素苷生物合成途徑上7個(gè)關(guān)鍵酶的依光表達(dá)是導(dǎo)致‘麗金’舌狀花呈色的直接原因。6.擴(kuò)增得到了4個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的cDNA全長(zhǎng)序列,分析發(fā)現(xiàn)只有CmMYB6的氨基酸序列中含有雙子葉植物中促進(jìn)花青素苷生物合成的R39、V64、A90和ANDV保守氨基酸位點(diǎn)；啟動(dòng)子序列分析結(jié)果表明,CmMYB6的啟動(dòng)子序列中含有3個(gè)光響應(yīng)元件和2個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)；與對(duì)照相比,CmMYB6轉(zhuǎn)基因煙草株系的花色明顯加深,花朵中花青素苷的相對(duì)含量顯著增加,并且CmMYB6, NtDFR和NtANS基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著上升,說(shuō)明CmMYB6的確是促進(jìn)菊花花青素苷依光合成和積累的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。綜合上述研究結(jié)果,作者初步推測(cè)出了菊花花青素苷依光合成的分子機(jī)制：頭狀花序感知光信號(hào)后,通過(guò)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑逐步激活菊花花青素苷生物合成途徑上編碼7個(gè)關(guān)鍵酶(CmCHS、CmF3H、CmF3'H、CmDFR、CmANS、Cm3GT和Cm3MT)的13個(gè)結(jié)構(gòu)基因家族成員(CmCHS1、CmCHS2、CmF3H、CmF3'H1、CmF3'H2、 CmF3'H3、CmDFR、CmANS1、CmANS2、CmANS3、Cm3GT、Cm3MT1和Cm3MT2)的表達(dá),從而促進(jìn)查爾酮、柚皮素、二氫山奈酚、二氫槲皮素、無(wú)色矢車菊素苷元、矢車菊素苷元和矢車菊素-3-葡萄糖苷等7個(gè)中間產(chǎn)物以及矢車菊素-3-O-(6"-O-丙二酰基-葡萄糖苷)和矢車菊素-3-O-(3",6"-O-二丙二�；�-葡萄糖苷)等2個(gè)矢車菊素衍生物(終產(chǎn)物)的合成與積累,最終促使舌狀花呈色。在13個(gè)結(jié)構(gòu)基因家族成員的依光表達(dá)過(guò)程中,正調(diào)節(jié)基因CmMYB5-1、CmMYB6和CmbHLH24以及負(fù)調(diào)節(jié)基因CmMYB7-1響應(yīng)光照并協(xié)同調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。本研究為深入理解觀賞植物花青素苷依光合成的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ),并為通過(guò)調(diào)節(jié)光照條件進(jìn)行菊花花色改良的分子育種研究提供了參考。
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【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S682.11
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本文編號(hào)：2364803