【摘要】：花青素苷是使花朵呈色的重要色素之一,其合成與積累過程與植物發(fā)育和外部環(huán)境條件密切相關(guān),但是目前環(huán)境因子對花青素苷生物合成調(diào)控的分子機制尚未得到清楚的解析。光是影響花青素苷生物合成最重要的環(huán)境因子之一,通過適當(dāng)調(diào)控觀賞植物生長的光照條件可以顯著提高其觀賞價值和經(jīng)濟價值。因此,解析光照調(diào)控花青素苷生物合成的分子機制具有理論價值和實際意義。菊花(Chrysanthemum xmorifolium Ramat.)是世界著名花卉,花色表型變異十分豐富,其簡單的色素代謝背景和呈色過程中對光照的高度敏感性使其成為研究花青素苷依光合成分子機制的理想材料。目前對菊花花青素苷依光合成的研究多集中在表型和生物化學(xué)分析層面,從分子水平上解析光照如何誘導(dǎo)花青素苷生物合成途徑上關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達則較少報道,并且調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因也尚未被鑒定和分離,限制了通過調(diào)節(jié)光照條件對菊花花色進行改良的分子育種研究。本研究以對光照條件高度敏感的紫色系菊花品種‘麗金’為研究材料,對遮光導(dǎo)致褪色的樣品中的色素成分及含量進行對比分析,并通過一系列生物信息學(xué)和基因表達分析解析了菊花花青素苷依光合成的分子機制。本研究獲得的主要結(jié)果如下。1.對‘麗金’的頭狀花序和葉片分別進行遮光處理,以正常光照處理和全株遮光分別作為陽性和陰性對照。花色表型變化的分析結(jié)果表明,3組遮光處理下舌狀花均明顯褪色,且花序遮光處理下的褪色比葉片遮光處理更顯著；色素分析結(jié)果表明,其舌狀花中含有2種矢車菊素衍生物和5種黃酮衍生物,并且3種遮光處理下舌狀花中花青素苷的相對含量隨花序發(fā)育呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢,下降的顯著程度與花色表型的分析結(jié)果一致。上述結(jié)果說明隨花序發(fā)育,光照顯著影響‘麗金’舌狀花中2種矢車菊素苷組分和含量的變化；其頭狀花序和葉片均能響應(yīng)光照并影響花青素苷的生物合成,但花序比葉片的感光能力更強：花序發(fā)育早期是花青素苷生物合成過程中響應(yīng)光照的關(guān)鍵時期。2.對‘麗金’花序發(fā)育的前3個階段進行遮光處理,并以正常光照處理作為對照組,構(gòu)建了5個轉(zhuǎn)錄組文庫；通過RNA序列的從頭組裝獲得了103,517個特異unigene,其中60,712(58.65%)個unigene在4個蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋；之后通過生物信息學(xué)分析篩選出了2,135個響應(yīng)光照的unigene;代謝通路分析結(jié)果表明,花青素苷代謝通路是唯一的既響應(yīng)光照又與花發(fā)育相關(guān)的完整通路；在遮光條件下,幾乎所有花青素苷生物合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因的表達都被抑制,與舌狀花褪色和花青素苷積累量的下降相吻合；通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,篩選出了4個參與調(diào)控菊花花青素苷依光合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。依據(jù)這些結(jié)果,推測花青素苷生物合成途徑上的13個結(jié)構(gòu)基因家族成員和4個轉(zhuǎn)錄因子隨花序發(fā)育的依光表達可能導(dǎo)致了‘麗金’舌狀花中花青素苷組分和含量發(fā)生變化。3.使用數(shù)字基因表達譜技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出了9個表達差異不顯著的候選內(nèi)參基因,之后使用geNorm、NormFinder和qBase plus對候選基因在不同光照處理下3個色系的‘麗金’品種中隨花序發(fā)育的表達穩(wěn)定性進行了綜合分析,并用CmF3H基因?qū)?nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行了驗證,發(fā)現(xiàn)CmF-box和CmPP2A是適用于不同光照處理下基因表達驗證分析的最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。這些結(jié)果為驗證17個候選基因的依光表達模式提供了最合適的內(nèi)參基因。4.使用上述在不同光照條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因,通過對比參與調(diào)控菊花花青素苷依光合成的候選結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因以及光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游基因在舌狀花和葉片中的表達模式,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的CmCHS1、CmCHS2、CmF3H、 CmF3'H1、CmF3'H2、 CmF3'H3、CmDFR、CmANS1、CmANS2、CmANS3、Cm3GT、 Cm3MT1、Cm3MT2、CmMYB5-1、CmMYB6、CmMYB7-1和CmbHLH24等17個基因家族成員的確是參與調(diào)控菊花花青素苷依光合成的關(guān)鍵基因,并且CmHY5的表達量與花青素苷的含量呈正相關(guān)關(guān)系,而CmPHYA、CmPHYB、CmCRY1a、 CmCRY1b和CmCRY2等5個光受體基因的表達與花青素苷的依光合成相關(guān)性較弱；CmCOP1基因的表達與花青素苷的含量也沒有明顯的相關(guān)性；此外,大多數(shù)花青素苷生物合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因在舌狀花中特異性表達。5.在轉(zhuǎn)錄組分析和基因表達驗證的基礎(chǔ)上,利用iTRAQ技術(shù)從‘麗金’舌狀花中鑒定得到5,106個原始蛋白,并從中篩選出了45個遮光后上調(diào)表達和115個下調(diào)表達的差異蛋白,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)花青素苷生物合成酶在遮光后下調(diào)表達,與編碼基因表達量的變化和花色表型的分析結(jié)果一致；遮光后,光捕獲葉綠體蛋白的表達豐度隨花序發(fā)育逐漸上升；通過功能和通路富集分析,推測GDSL脂酶可能在菊花花青素苷依光合成的過程中發(fā)揮作用。這些結(jié)果說明花青素苷生物合成途徑上7個關(guān)鍵酶的依光表達是導(dǎo)致‘麗金’舌狀花呈色的直接原因。6.擴增得到了4個關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的cDNA全長序列,分析發(fā)現(xiàn)只有CmMYB6的氨基酸序列中含有雙子葉植物中促進花青素苷生物合成的R39、V64、A90和ANDV保守氨基酸位點；啟動子序列分析結(jié)果表明,CmMYB6的啟動子序列中含有3個光響應(yīng)元件和2個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點；與對照相比,CmMYB6轉(zhuǎn)基因煙草株系的花色明顯加深,花朵中花青素苷的相對含量顯著增加,并且CmMYB6, NtDFR和NtANS基因的相對表達量也顯著上升,說明CmMYB6的確是促進菊花花青素苷依光合成和積累的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。綜合上述研究結(jié)果,作者初步推測出了菊花花青素苷依光合成的分子機制：頭狀花序感知光信號后,通過光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑逐步激活菊花花青素苷生物合成途徑上編碼7個關(guān)鍵酶(CmCHS、CmF3H、CmF3'H、CmDFR、CmANS、Cm3GT和Cm3MT)的13個結(jié)構(gòu)基因家族成員(CmCHS1、CmCHS2、CmF3H、CmF3'H1、CmF3'H2、 CmF3'H3、CmDFR、CmANS1、CmANS2、CmANS3、Cm3GT、Cm3MT1和Cm3MT2)的表達,從而促進查爾酮、柚皮素、二氫山奈酚、二氫槲皮素、無色矢車菊素苷元、矢車菊素苷元和矢車菊素-3-葡萄糖苷等7個中間產(chǎn)物以及矢車菊素-3-O-(6"-O-丙二�；�-葡萄糖苷)和矢車菊素-3-O-(3",6"-O-二丙二酰基-葡萄糖苷)等2個矢車菊素衍生物(終產(chǎn)物)的合成與積累,最終促使舌狀花呈色。在13個結(jié)構(gòu)基因家族成員的依光表達過程中,正調(diào)節(jié)基因CmMYB5-1、CmMYB6和CmbHLH24以及負調(diào)節(jié)基因CmMYB7-1響應(yīng)光照并協(xié)同調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達。本研究為深入理解觀賞植物花青素苷依光合成的分子機制奠定了理論基礎(chǔ),并為通過調(diào)節(jié)光照條件進行菊花花色改良的分子育種研究提供了參考。
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【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S682.11
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本文編號：2364803