【摘要】：豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis, TGE)是導(dǎo)致仔豬早期死亡的主要疫病之一。該病雖有疫苗預(yù)防,但免疫失敗時(shí)有發(fā)生,而西藥應(yīng)用又存在著藥物殘留等一系列影響人體健康的食品安全問(wèn)題。開(kāi)發(fā)安全、有效、綠色、環(huán)保的新型中獸藥成為當(dāng)務(wù)之急。故此,本研究以中藥復(fù)方為試驗(yàn)材料,以豬小腸黏膜上皮細(xì)胞(SIEC)為研究對(duì)象,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及熒光顯微鏡等手段和方法,通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期、相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路途徑、豬氨基肽酶N及抗病毒因子的檢測(cè),探討中藥復(fù)方干預(yù)TGEV誘導(dǎo)SIEC凋亡的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用中獸藥防控畜禽傳染病奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：1、通過(guò)顯微鏡觀察結(jié)合MTT法,篩定出中藥復(fù)方對(duì)SIEC的最大安全濃度：復(fù)方參術(shù)湯為6.25mg/mL,復(fù)方連翁湯為1.5625mg/mL,復(fù)方參附湯為3.125mg/mL。2、通過(guò)MTT法,檢測(cè)中藥復(fù)方干預(yù)TGEV誘導(dǎo)SIEC與PK-15細(xì)胞的活性的影響,結(jié)果顯示三種中藥復(fù)方均能體外抑制TGEV對(duì)SIEC與PK-15細(xì)胞的吸附作用。3、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)中藥復(fù)方干預(yù)TGEV誘導(dǎo)SIEC細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示中藥復(fù)方可以改變由TGEV引起的細(xì)胞周期在G2/M期發(fā)生的阻滯；qRT-PCR檢測(cè)參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白,結(jié)果顯示中藥復(fù)方能夠顯著上調(diào)周期蛋白cyclinA與cyclinB1的轉(zhuǎn)錄量(P0.05)；熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)中藥復(fù)方處理后感染TGEV的SIEC,結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)比較清晰、完整,呈規(guī)則的長(zhǎng)梭形,大部分細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)較清晰,染色質(zhì)著色較均一,凋亡現(xiàn)象不明顯。4、通過(guò)Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示中藥復(fù)方可下調(diào)TGEV感染SIEC后Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、Cyt c及Bid蛋白表達(dá)；qRT-PCR和Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示中藥復(fù)方可以極顯著上調(diào)Fas和Bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄(P0.01)及其蛋白的表達(dá),極顯著下調(diào)Fasl和Bax　mRNA的轉(zhuǎn)錄(P0.01)及其蛋白表達(dá)；SIEC經(jīng)Caspase抑制劑處理后與TGEV組相比,可下調(diào)Caspase-8、Caspase-9、 Caspase-3蛋白的表達(dá)。5、通過(guò)qRT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示中藥復(fù)方可下調(diào)TGEV的受體pAPN mRNA表達(dá)水平和正向調(diào)控GRP78 mRNA表達(dá)水平。6、通過(guò)qRT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示中藥復(fù)方TNF-a mRNA轉(zhuǎn)錄量高于對(duì)照組；中藥復(fù)方IFN-p mRNA轉(zhuǎn)錄量高于TGEV組；中藥復(fù)方TLR3 mRNA轉(zhuǎn)錄量在24h、48h、72h時(shí)均極顯著低于對(duì)照組(P0.01),而高于TGEV組但差異不顯著。中藥復(fù)方NF-kB mRNA轉(zhuǎn)錄量在各時(shí)間段均顯著高于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論：1、中藥復(fù)方在適宜濃度范圍內(nèi)(復(fù)方參術(shù)湯為6.25 mg/mL,復(fù)方連翁湯為1.5625mg/mL,復(fù)方參附湯為3.125mg/mL),對(duì)SIEC既安全又無(wú)毒副作用,且能有效抑制TGEV對(duì)SIEC的吸附,明顯改善由TGEV感染SIEC產(chǎn)生的CPE現(xiàn)象,從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。2、中藥復(fù)方能夠正向調(diào)控SIEC關(guān)鍵的凋亡因子(Fas/Fas1、Bcl-2/Bax、Cyt-c、Bid)、周期蛋白(cycliA、cyclinB1)及TGEV受體(pAPN)基因或蛋白的表達(dá)水平,從而抑制Caspase的活性、改善細(xì)胞周期活動(dòng)、阻斷TGEV的吸附和在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,達(dá)到抑制TGEV誘導(dǎo)SIEC凋亡的目的。3、中藥復(fù)方可以通過(guò)提高相關(guān)抗病毒因子(IFN-β、TNF-α、 TLR3、NF-kB)的轉(zhuǎn)錄量,抑制病毒基因組復(fù)制或干擾其蛋白合成等方式發(fā)揮抑制TGEV增殖的作用。整體研究最終表明,中藥復(fù)方具有預(yù)防TGEV感染SIEC的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2363663