【摘要】：葡萄病毒病是影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。葡萄病毒病種類很多,其中,葡萄卷葉病和葡萄扇葉衰退病在我國(guó)發(fā)生普遍,危害嚴(yán)重。葡葡卷葉病的典型癥狀為卷葉,由幾種葡萄卷葉相關(guān)病毒(GLRa Vs)引起。而葡萄扇葉衰退病的癥狀表現(xiàn)復(fù)雜,類型多樣,其中,引起環(huán)斑癥狀的相關(guān)病毒種類尚不明確。本研究對(duì)我國(guó)葡萄卷葉及環(huán)斑癥狀相關(guān)的病毒種類進(jìn)行鑒定,并對(duì)相關(guān)病毒的分子特性進(jìn)行研究。結(jié)果如下:1.我國(guó)葡萄樣品中GLRa Vs的檢測(cè)。本研究針對(duì)葡萄卷葉相關(guān)病毒1、4和7(Grapevine leafroll-associated virus-1,-4和-7,GLRa V-1、4和7)的CP和HSP70基因設(shè)計(jì)引物,研究建立了這幾種病毒的]閌絉T-PCR方法,對(duì)來(lái)自14個(gè)省和自治區(qū)的100余份葡萄樣品進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示巢式RT-PCR具有較高的靈敏度,能夠檢測(cè)更多的病毒分離物。GLRa V-1,GLRa V-4和GLRa V-7在這些樣品中的檢出率分別為27.3%(36/132),43.2%(57/132),23.4%(44/188)。2.GLRa V-1、4和7中國(guó)分離物的遺傳多樣性分析。本研究共獲得GLRa V-1中國(guó)分離物的43條CP和21條HSP70基因序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示全球的GLRa V-1分離物的CP和HSP70基因序列分別劃分為8個(gè)和7個(gè)組群,中國(guó)分離物分屬于其中的5個(gè)和4個(gè)組群。CP基因進(jìn)化樹分析結(jié)果表明組4是一個(gè)新的組群。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示屬于CP基因組群2和8的變種是由于自然選擇而非隨機(jī)突變進(jìn)化的結(jié)果。另外,在CP基因序列中發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的重組序列。本研究獲得了GLRa V-4的22條CP和19條HSP70基因序列,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示GLRa V-4株系5、6、9、Pr和Car的變種形成各自獨(dú)立的分支,而其他的GLRa V-4變種可劃分為兩個(gè)組群,一些中國(guó)分離物與其他幾個(gè)國(guó)家的分離物劃分為group1,包含日本分離物Ru1和Ru2的組群劃分為group2。對(duì)HSP70基因序列的重組分析表明分離物L(fēng)N-Ths4 clone3和HB-JF clone4為重組序列。本研究共獲得GLRa V-7分離物的45條CP和16條HSP70基因序列,基因變異分析結(jié)果表明獲得的CP基因序列的核苷酸/氨基酸的同源性為89.12%~100%/88.94%~100%,HSP70基因序列的核苷酸/氨基酸的同源性為85.33%~100%/88.97%~100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明所有的CP和HSP70基因序列可分別劃分5個(gè)和4個(gè)組群。CP和HSP70基因進(jìn)化樹中的組群3和4是兩個(gè)新的組群。此外,CP基因序列的重組分析表明分離物L(fēng)N-ZF clone9的CP基因序列為一個(gè)重組序列。3.一個(gè)新的雙生病毒及兩個(gè)新的GINV變種的基因組測(cè)定。對(duì)表現(xiàn)環(huán)斑癥狀的‘安尼斯基’、‘貝達(dá)’及健康的‘貝達(dá)’葡萄樣品進(jìn)行小RNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雙生病毒及GINV的兩個(gè)新變種。采用PCR擴(kuò)增及滾環(huán)擴(kuò)增方法對(duì)‘安尼斯基’中的雙生病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增,確定雙生病毒基因組全長(zhǎng)為2905 bp。該基因組具有雙生病毒特有的高度保守的核苷酸序列TAATATTAC,其ORFs(Open reading frames)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該雙生病毒包含7個(gè)ORFs,其中6個(gè)ORFS與已報(bào)道雙生病毒的ORFs同源性為23%~67%。本研究表明該雙生病毒為葡萄上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新病毒,由于它似乎不能引起葡萄明顯的癥狀,故暫時(shí)命名為葡萄潛隱雙生病毒(Grapevine latent geminivirus,GLGV)。本研究獲得了兩個(gè)中國(guó)GINV分離物L(fēng)N_ANSJ_RS(Gen Ban K登錄號(hào):KU971246)和LN_BETA_RS(Gen Ban K登錄號(hào):KU234316),其與日本分離物(D88448)的RP基因的核苷酸/氨基酸同源性分別為71.02%/76.75%和71.29%/77.15%,CP基因的核苷酸/氨基酸同源性分別為78.91%/86.67%和80.27%/89.74%。中國(guó)分離物L(fēng)N_ANSJ_RS和LN_BETA_RS之間RP和CP之間的核苷酸/氨基酸同源性為74.87%/82.09%,83.16%/94.36%。GINV與發(fā)狀病毒屬(Trichovirus)其他成員的RP、MP及CP基因的氨基酸進(jìn)化樹分析結(jié)果表明LN_ANSJ_RS、LN_BETA_RS及日本分離物處于GINV大分支上的3個(gè)不同的小分支上,為GINV的3個(gè)不同的變種。這是GINV在中國(guó)的首次報(bào)道。研究結(jié)果也初步表明GINV與環(huán)斑癥狀緊密相關(guān)。4.GINV的檢測(cè)及遺傳多樣性分析。針對(duì)GINV分離物的MP和CP基因分別設(shè)計(jì)引物,對(duì)來(lái)自15個(gè)省和自治區(qū)的195個(gè)葡萄樣品進(jìn)行了PCR和巢式PCR檢測(cè),結(jié)果表明GINV總的檢出率為35.9%(70/195)。屬于13個(gè)品種的17個(gè)葡萄樣品表現(xiàn)明顯環(huán)斑癥狀,其GINV檢出率為94.1%(16/17)。CP基因和MP基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明GINV分離物可劃分為3個(gè)組群,其中組3僅由中國(guó)分離物L(fēng)N-Beta2與日本分離物(D88448)組成,組1和組2為兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的組群,僅由中國(guó)分離物組成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S436.631

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本文編號(hào)：2330447