【摘要】：在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中,花粉的充足供應是工蜂咽下腺發(fā)育的重要保證。同時,人們也時常發(fā)現(xiàn),幼蟲的存在刺激著工蜂咽下腺的發(fā)育。也就是說,花粉供應是否充足(營養(yǎng)因素),以及蜂巢內(nèi)是否存在幼蟲(幼蟲誘導),是影響工蜂咽下腺發(fā)育的二大重要因素。迄今為止,營養(yǎng)和幼蟲誘導對蜜蜂咽下腺發(fā)育的分子調(diào)節(jié)機制仍不清楚。本研究以意大利蜜蜂為試驗對象,以營養(yǎng)和幼蟲誘導為試驗因子,利用組織細胞學、分子生物學和生物信息學技術探索其對咽下腺發(fā)育的分子調(diào)控機制,為闡明工蜂泌漿的分子機制奠定基礎。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.營養(yǎng)和幼蟲誘導對意大利蜜蜂咽下腺發(fā)育的影響為探究營養(yǎng)和幼蟲誘導對蜜蜂咽下腺發(fā)育的影響,試驗選取健康、群勢一致的姐妹蜂王群9群,隨機分為3個組,每組3個重復,每個重復1群蜂。1個組飼喂蜂蜜(honey),命名為Hon組,作為對照組;1個組飼喂蜂蜜和花粉(pollen),命名為Pol組;1個組在飼喂蜂蜜和花粉的同時,以幼蟲(brood)誘導,命名為Bro組。試驗期間,各組提供充足的蜂蜜或花粉,試驗期為12天。試驗第1天標記足量新出房工蜂,分別于試驗的第6天、9天、12天采集被標記蜜蜂。采用BCA試劑盒測定第6、9、12天被標記蜜蜂咽下腺組織蛋白含量;利用透射電鏡觀察第9天被標記蜜蜂咽下腺細胞的超微結(jié)構(gòu);應用IlluminaHiSeqTM 2500雙末端測序技術測定第9天被標記蜜蜂咽下腺總RNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如下:(1)Bro組、Pol組和Hon組的工蜂咽下腺組織蛋白含量在各日齡差異極顯著,均是以9日齡最高,6日齡最低(P0.01);同時發(fā)現(xiàn)9日齡工蜂咽下腺蛋白含量在3組中差異極顯著,Bro組Pol組Hon組(P0.01)。(2)超微結(jié)構(gòu)結(jié)果發(fā)現(xiàn),Bro組和Pol組咽下腺細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多呈長管狀或小泡狀,其外表面附有大量核糖體,而Hon組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔很窄、其外表面附著核糖體較少;各組咽下腺細胞胞內(nèi)分泌管體積依次為:Bro組Pol組Hon組。(3)采用生物信息學分析轉(zhuǎn)錄結(jié)果,共檢測到7種可變剪切類型,累計SNP位點數(shù)達87792個;共發(fā)現(xiàn)新基因360個,其中有230個注釋到COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫中;共檢測到2,801個差異表達基因,其中Hon組和Pol組、Hon組和Bro組、Pol組和Bro組間的差異基因個數(shù)為220、2,380、1,658,分別有213、2328、1617個注釋到各類數(shù)據(jù)庫中;途徑富集分析表明,與幼蟲誘導相關的基因主要參與了氧化磷酸化生物過程和Wnt信號通路,營養(yǎng)特異基因主要參與了過氧化物酶體、果糖和甘露糖的代謝活動,而花粉和幼蟲誘導共同作用的特異基因主要參與了核糖體蛋白、氧化磷酸化和tor信號通路及支鏈氨基酸代謝過程;特別關注了9個mrjps基因,對mrjps基因進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)mrjp4和mrjp7、mrjp5和mrjp8是功能相近的兩組基因。2.候選基因的功能分析及驗證為了挖掘調(diào)控咽下腺發(fā)育的重要基因,我們首先采用維恩分析比較了試驗一中hon組、pol組和bro組兩兩之間的共同差異基因,共發(fā)現(xiàn)36個,其中mrjp2、mrjp3、loc724114和loc410337受花粉和幼蟲的疊加誘導,表達水平升高幅度較大,因此我們以這4個基因作為我們的目的基因,對其進行功能分析及驗證分析。試驗采集新出房工蜂1980只,隨機分為6組(a組、b組、c組、d組、e組、f組),每組3個重復,每個重復110只蜜蜂,于室內(nèi)蜜蜂飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng),試驗期為15天。a組飼喂蜂蜜;b組飼喂蜂蜜和油菜花粉;c組飼喂蜂蜜和油菜花粉,并將一塊帶有小幼蟲的巢脾放入飼喂盒內(nèi),以誘導蜜蜂哺育;d組前9天飼喂蜂蜜,后6天飼喂蜂蜜和油菜花粉;e組前9天飼喂蜂蜜,后6天飼喂蜂蜜和油菜花粉,并用具小幼蟲巢脾誘導;f組前9天飼喂蜂蜜和油菜花粉,后6天在飼喂蜂蜜和油菜花粉的基礎上,用小幼蟲誘導。首先,a(hon)、b(pol)、c(bro)三組在飼養(yǎng)的第1、3、6、9和12天各取10只蜜蜂解剖,分離其頭部、胸部肌肉、腹部表皮、中腸和毒腺5個部位,提取各部位總rna,采用qrt-pcr方法測定目的基因在不同發(fā)育時期和不同組織部位的表達水平。其次,在飼養(yǎng)的第9天,a、b、c組每盒取30只蜜蜂;第15天,a、b、c、d、e、f組每盒取30只蜜蜂;解剖分離蜜蜂咽下腺,提取總rna,測定目的基因mrna表達水平。結(jié)果表明:(1)花粉+幼蟲誘導基因loc724114和loc410337在9日齡頭部和中腸中高表達;而基因mrjp2和mrjp3主要在9日齡工蜂頭部、肌肉和表皮中表達;(2)loc724114、loc410337、mrjp2和mrjp3在花粉和花粉+幼蟲的誘導下,均是在9日齡具有高表達,到15日齡時,表達量顯著降低(p0.01);(3)基因loc410337和loc724114主要受花粉+幼蟲的共同調(diào)控作用;而mrjp2和mrjp3受花粉和幼蟲的疊加調(diào)節(jié)作用。本研究表明,營養(yǎng)和幼蟲誘導刺激咽下腺細胞內(nèi)各種細胞器增多,提高了其合成組織蛋白的能力,促進工蜂咽下腺的發(fā)育;營養(yǎng)和幼蟲誘導影響工蜂咽下腺基因組的轉(zhuǎn)錄。營養(yǎng)和幼蟲誘導下的degs,主要通過在ribosome通路中正調(diào)控作用和在tor、wnt信號通路中的負調(diào)控作用共同影響工蜂咽下腺的發(fā)育;花粉(營養(yǎng))是咽下腺發(fā)育的必需營養(yǎng)物質(zhì),幼蟲的存在是促使咽下腺發(fā)育的關鍵誘因,營養(yǎng)和幼蟲誘導是調(diào)控咽下腺發(fā)育的兩種關鍵因素。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S891

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本文編號：2326809