【摘要】：雞具有重要的經(jīng)濟(jì)效益并且它的近交系很容易獲得,因此,它常被用于禽類免疫學(xué)研究。法氏囊(Bursa of Fabricius,BF)是禽類特有的中樞免疫器官,在B細(xì)胞的分化和抗體產(chǎn)生方面有著至關(guān)重要的作用。雛雞的獲得性免疫系統(tǒng)在出生一周之后才具有完善功能,因此先天性免疫在新生雛雞中發(fā)揮重要的作用。在不同傳染病中,法氏囊的急性萎縮是一個(gè)共同特性。許多研究指出鼠傷寒沙門氏菌來源的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可影響禽類中樞免疫器官。然而,LPS刺激誘導(dǎo)的雛雞法氏囊微觀結(jié)構(gòu)改變的轉(zhuǎn)錄組水平分子機(jī)制目前還不甚清楚。因此,本研究以1日齡雛雞為試驗(yàn)動(dòng)物,腹腔注射生理鹽水或鼠傷寒沙門氏菌來源的LPS(50mg/kg)。分別在注射0,2,6,12,36,72和120h時(shí),取法氏囊組織,一部分組織采用4%多聚甲醛固定保存用于組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn),一部分組織采用2.5%戊二醛溶液固定保存用于掃描電鏡觀察,一部分組織快速儲(chǔ)存在-70℃超低溫冰箱用于RNA-seq和分子生物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.LPS刺激對(duì)雛雞法氏囊的影響1.1 LPS刺激誘導(dǎo)雛雞法氏囊急性萎縮與生理鹽水組相比,腹腔注射50mg/kgLPS36h時(shí),法氏囊重量(?36%)及法氏囊指數(shù)均顯著下降(?18%)。另外,LPS刺激誘導(dǎo)的雛雞法氏囊急性萎縮呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。以上研究結(jié)果表明,采用50mg/kg劑量的LPS刺激1日齡雛雞36h時(shí)可誘導(dǎo)法氏囊顯著萎縮。1.2 LPS刺激對(duì)雛雞法氏囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響HE染色結(jié)果顯示,LPS刺激可破壞法氏囊的結(jié)構(gòu)完整性。與對(duì)照組相比,LPS刺激12h,36h,72h時(shí)異嗜性粒細(xì)胞數(shù)目增加,血管內(nèi)或血管周圍紅細(xì)胞數(shù)量增加。在LPS刺激36h時(shí),法氏囊濾泡髓質(zhì)內(nèi)異嗜性細(xì)胞聚集增多,法氏囊濾泡外圍邊界被明顯破壞。以上研究結(jié)果表明,LPS刺激不僅導(dǎo)致雛雞法氏囊炎癥變化,而且導(dǎo)致雞法氏囊結(jié)構(gòu)破壞。1.3 LPS刺激對(duì)雛雞法氏囊超微結(jié)構(gòu)的影響掃描電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示,生理鹽水組黏膜面光滑,而LPS刺激12h時(shí)黏膜受到了嚴(yán)重的侵蝕與破壞,刺激36h時(shí),法氏囊黏膜上皮細(xì)胞完全脫落。以上研究結(jié)果表明,LPS刺激12h時(shí)由于炎性反應(yīng)導(dǎo)致法氏囊黏膜損傷,36h時(shí)法氏囊顯著萎縮可能與大量上皮細(xì)胞脫落有關(guān)。1.4 LPS刺激對(duì)雛雞法氏囊內(nèi)免疫相關(guān)細(xì)胞的影響甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示,生理鹽水組和LPS刺激組中,肥大細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)沒有發(fā)生顯著的變化,但在LPS刺激12h,36h和72h時(shí),肥大細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。變色酸2R染色結(jié)果顯示,LPS刺激12h和36h時(shí)嗜酸異嗜性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增多。1.5 LPS刺激后TLR4和NF-κB的表達(dá)免疫組化染色和免疫印跡結(jié)果表明,LPS刺激12h和36h時(shí)TLR4和NF-κB的表達(dá)增強(qiáng)。以上研究結(jié)果表明,LPS刺激不僅能激活雞法氏囊中TLR4的表達(dá),而且也能激活其下游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)。1.6 LPS刺激對(duì)雛雞雞法氏囊細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的影響采用TUNEL法和Formamide-MAb法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè),與生理鹽水組相比,LPS刺激12h和36h時(shí),細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)。細(xì)胞增殖檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PCNA的表達(dá)在LPS刺激12h和36h時(shí)顯著下調(diào)。以上研究結(jié)果表明,LPS刺激可促進(jìn)雛雞法氏囊細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。2.LPS刺激誘導(dǎo)雛雞法氏囊微觀結(jié)構(gòu)變化時(shí)的轉(zhuǎn)錄組分析2.1 RNA-seq及鑒定差異表達(dá)基因采用SE50測(cè)序策略,組間比較(生理鹽水組VS LPS組)進(jìn)行RNA測(cè)序,采用NOISeq方法比較分析不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)譜,探索差異表達(dá)基因(DEGs)。從RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中隨機(jī)選擇候選的DEGs,采用RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。2.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析GO和KEGG分析表明,LPS刺激早期,大量的DEGs主要富集到代謝、免疫和遺傳信息系統(tǒng)。與這些結(jié)果一致,Reactome分析也發(fā)現(xiàn)大量的DEGs主要富集到免疫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝通路。此外,LPS刺激早期,法氏囊內(nèi)免疫系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相互作用也發(fā)生了顯著改變。因此,比較KEGG和Reactome數(shù)據(jù)庫DEGs發(fā)現(xiàn),DEGs以相似的途徑參與調(diào)節(jié)。隨后,采用蛋白質(zhì)功能的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析在蛋白質(zhì)水平分析了這些基因的互作,發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的早期,許多候選基因和驗(yàn)證基因(通過RT-qPCR)如蛋白激酶9和TGFBR1,HSPB1,SASH3和E2F1在蛋白質(zhì)交互系統(tǒng)(PPI)中有著較強(qiáng)的相互作用。2.3集成功能信號(hào)途徑分析集成路徑分析表明,大部分的候選基因在有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通路中富集。在MAPK信號(hào)通路中,轉(zhuǎn)錄因子如RAS,FGFR,c-Jun(JUN),p53和JNK表達(dá)上調(diào),而HSP27,MEK2,crk2和Akt1表達(dá)下調(diào)。富集到的TLRs信號(hào)通路中,NF-κB,p105,JNK,CD80表達(dá)上調(diào),而AKT and MEKI/II表達(dá)下調(diào)。綜上所述,LPS刺激的早期階段,不僅可以誘導(dǎo)法氏囊急性萎縮,破壞法氏囊的結(jié)構(gòu)完整性,導(dǎo)致異嗜細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,而且引起細(xì)胞增殖減少,細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。此外,轉(zhuǎn)錄組分析表明,LPS刺激早期誘導(dǎo)的雛雞法氏囊微觀形態(tài)變化可能受到LPS//TLR4/MAPK信號(hào)途徑中下游活化的轉(zhuǎn)錄分子CNN1,E2F1和HRAS的調(diào)節(jié)。
[Abstract]:Chicken has important economic benefits and its inbred line is easy to obtain. Therefore, it is often used in avian immunology research. Bursa of Fabricus (BF) is a unique central immune organ in poultry and plays an important role in the differentiation of B cells and antibody production. The chicken feeding system has a perfect function after one week of birth, so it plays an important role in the newborn chicks. In different infectious diseases, the acute atrophy of bursa of Fabricius is a common characteristic. Many studies indicate that lipopolysaccharides (LPS) derived from Salmonella typhimurium can affect avian central immune organs. However, the molecular mechanism of the transcription group induced by LPS stimulation on the microstructure of the bursa of Fabricius is not very clear. Therefore, 1 day-old chicken was used as test animal, and LPS (50mg/ kg) from the source of Salmonella typhimurium was injected into the abdominal cavity. After injection of 0, 2, 6, 12, 36, 72 and 120h, the bursa of Fabricius was obtained. A part of the tissues were fixed and preserved for morphological experiment using 4% glutaraldehyde, and some tissues were fixed with 2.5% glutaraldehyde solution for SEM observation. A portion of the tissue was rapidly stored at -70 鈩，

本文編號(hào)：2312455