【摘要】：桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)是熱帶和亞熱帶地區(qū)嚴(yán)重危害果蔬的重要經(jīng)濟害蟲,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不可估計的損失。由于長期化學(xué)防治的壓力,桔小實蠅對常用殺蟲劑包括有機磷類殺蟲劑已產(chǎn)生了不同程度的抗性。前期研究表明,細(xì)胞色素P450在昆蟲對有機磷類殺蟲劑代謝抗性中起重要作用,而且根據(jù)增效試驗以及代謝酶活性測定,桔小實蠅細(xì)胞色素P450與有機磷類殺蟲劑如馬拉硫磷的代謝抗性密切相關(guān)。據(jù)此,為揭示桔小實蠅細(xì)胞色素P450介導(dǎo)代謝抗性的分子機理,本學(xué)位論文首先克隆獲得了桔小實蠅P450基因cDNA全長序列,全面了解桔小實蠅P450基因的序列信息;定量分析了P450基因在桔小實蠅體內(nèi)的表達(dá)分布特點和應(yīng)對外源物的反應(yīng);克隆獲得桔小實蠅細(xì)胞色素P450還原酶基因,定量分析了BdCPR表達(dá)分布特點,并通過RNAi和真核表達(dá)等技術(shù),探究桔小實蠅細(xì)胞色素P450還原酶基因與馬拉硫磷抗性的關(guān)系,進(jìn)而初步判斷P450酶系在桔小實蠅馬拉硫磷抗性中的作用;通過轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq技術(shù),分析比較了桔小實蠅成蟲及其中腸和脂肪體在馬拉硫磷抗性品系和敏感品系間表達(dá)量的差異,篩選鑒定出桔小實蠅中與馬拉硫磷抗性相關(guān)的基因;最后,結(jié)合RNAi和真核表達(dá)等技術(shù)分析P450基因在馬拉硫磷抗性中的作用。本研究為桔小實蠅的代謝抗性分子機理建立理論基礎(chǔ),主要研究結(jié)果如下:1桔小實蠅細(xì)胞色素P450基因的克隆與序列分析通過簡并引物、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和RACE技術(shù),共克隆和鑒定出桔小實蠅38個具有完整開放閱讀框的細(xì)胞色素450基因。這38個P450基因分布于4個集團(tuán)14個家族27個亞家族中,其中CYP2、CYP3、CYP4和mitochondrial集團(tuán)分別有2個、19個、11個和6個P450基因,第四家族和第六家族P450基因分別為11個和12個,第12家族為4個,其他11個家族均為1個。38個P450基因的開放閱讀框長度介于1350-1665 bp,編碼489-554個氨基酸。編碼蛋白的分子量介于57-64kDa,理論等電點介于5.88-9.62。通過對序列的分析,預(yù)測38個P450中有32個屬于微粒體P450,6個為線粒體P450。桔小實蠅38個P450基因均獲得細(xì)胞色素P450命名委員會命名,分別為CYP4AC4、CYP4AD1、CYP4D46、CYP4D47、CYP4D48、CYP4E9、CYP4G100、CYP4G101、CYP4P5、CYP4P6、CYP4S18、CYP6A41、CYP6A48、CYP6A49、CYP6A50、CYP6A61、CYP6A62、CYP6D9、CYP6D12、CYP6EK1、CYP6G6、CYP6G8、CYP6GX1、CYP9F6、CYP12A18、CYP12B3、CYP12C2、CYP12N1、CYP28F1、CYP302A1、CYP304A1、CYP305A1、CYP309B1、CYP310C1、CYP314A1、CYP317B1、CYP437A3和CYP3074A1,并在Gen Bank中登錄,登錄號依次為ADC44464、KX708477、ADC44459、ADP22308、ADP22303、ADP22302、KX708478、KX708479、ADC44461、AFH54172、KX708480、ADP22304、KX708481、KX708482、KX708483、KX708484、KX708485、ADO24531、KX708486、ADP22309、KX708487、KX708488、KX708489、KX708490、KX708491、KX708492、AFH54190、AFH54188、AFH54196、AFH54200、KX708493、KX708494、KX708495、AFH54207、AFH54210、KX708496、KX708497和KX708498。多重序列比對顯示11個CYP4家族成員的氨基酸序列一致性介于25%-67%,12個CYP6家族成員的氨基酸序列一致性介于26%-60%,相同亞家族成員的序列一致性較高,而不同家族的P450基因序列一致性普遍較低。這些P450基因均具有P450大家族的保守結(jié)構(gòu)域Helix C、Helix I、Helix K、Meander和血紅素結(jié)合區(qū)域等。桔小實蠅P450基因與實蠅類害蟲橄欖實蠅、瓜實蠅和地中海實蠅的同源P450基因氨基酸序列的一致性分別介于79%-97%、74%-95%和70%-94%,序列相似性非常高,與果蠅同源P450基因的序列一致性介于35%-78%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示38個P450基因和87個果蠅P450基因按集團(tuán)聚集成4個不同的分支,其中CYP3和CYP4集團(tuán)的兩個分支基因最多,相同家族以及同源基因距離較近。2桔小實蠅細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)模式解析運用q PCR技術(shù),定量檢測了桔小實蠅P450基因在不同地理種群、不同發(fā)育階段、不同組織以及雌雄成蟲及其中腸間的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示,在桔小實蠅云南、海南、東莞和廣州等4個種群中,CYP6P5在東莞和廣州種群的表達(dá)量高于在云南和海南種群的表達(dá)量,CYP6EK1則在廣州種群的表達(dá)量最高,其余6個被檢測的P450基因在4個種群的表達(dá)量無顯著差異。在桔小實蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲中,數(shù)字表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示不同P450基因在數(shù)據(jù)庫中可以對應(yīng)1-4個片段,相同基因的不同片段對應(yīng)的不同發(fā)育階段的表達(dá)量非常相似,而且與定量檢測結(jié)果一致(CYP4D47除外);8個檢測的P450基因均在幼蟲和成蟲階段的表達(dá)量較高,其次是蛹期,而在卵期的表達(dá)量則普遍最低;相同亞家族的P450基因CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式具有差異。在桔小實蠅成蟲不同組織(中腸、脂肪體和馬氏管)中,相同亞家族的CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在中腸的表達(dá)量最高,表達(dá)模式非常相近;CYP4AC4和CYP4E9在脂肪體的表達(dá)量最高,CYP4P5和CYP6EK1在馬氏管的表達(dá)量最高,P450基因在組織間的表達(dá)差異可達(dá)到750倍,而CYP6A41在3種組織的表達(dá)量無顯著差異。在桔小實蠅3日齡雌雄成蟲中,檢測的15個P450基因的表達(dá)量均無雌雄差異;而在桔小實蠅雌雄成蟲中腸,CYP12N1在雌蟲中腸的表達(dá)量是其在雄蟲中腸表達(dá)量的0.28倍,顯著低于在雄蟲中腸的表達(dá)量,其他14個P450基因在雌雄中腸間無明顯差異。此外,檢測了桔小實蠅P450基因在外源物處理下的應(yīng)激反應(yīng)。使用高效氯氰菊酯LD50處理成蟲24 h后,15個P450基因的表達(dá)量均無顯著變化;而在成蟲中腸,CYP4AC4、CYP4D46、CYP4P6和CYP302A1的表達(dá)量在高效氯氰菊酯處理后均下降,分別為對照組的0.33、0.37、0.61和0.53倍,其他11個P450基因的表達(dá)量在高效氯氰菊酯處理后無明顯變化。使用含3 g/L和10 g/L植物次生物質(zhì)檸檬醛的飼料飼喂桔小實蠅成蟲,24 h后的死亡率分別為2%和30%;CYP4D46在3 g/L檸檬醛處理后表達(dá)量下降,CYP12N1、CYP302A1和CYP314A1在兩種濃度檸檬醛處理后表達(dá)量均下調(diào),而CYP28F1在3 g/L檸檬醛處理后表達(dá)量上升,CYP4D48和CYP6D9在10 g/L檸檬醛處理后表達(dá)量升高,但增加幅度均較小。3桔小實蠅細(xì)胞色素P450還原酶基因的克隆與功能研究通過簡并引物、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RACE技術(shù),擴增出桔小實蠅細(xì)胞色素P450還原酶BdCPR的兩個轉(zhuǎn)錄本BdCRP-X1和BdCPR-X2,開放閱讀框長度為2019 bp和1674 bp,分別編碼672個和557個氨基酸。BdCPR-X1和BdCPR-X2編碼蛋白的理論分子量為76 kDa和64 kDa,理論等電點為5.51和7.23。兩個轉(zhuǎn)錄本的N端序列不同,而C端則一致。BdCPR-X1含有CPR完整的功能結(jié)構(gòu)域FMN、FAD和NADPH,其N端具有膜錨定區(qū)域;而BdCPR-X2具有功能結(jié)構(gòu)域FMN、FAD和NADPH,但FMN不完整,且不具有N端的膜錨定序列。桔小實蠅BdCPR-X1和BdCPR-X2的氨基酸序列與其他物種的CPR氨基酸序列具有較高的一致性。其中,與瓜實蠅和地中海實蠅CPR序列的一致性超過90%,與家蠅和果蠅的CPR序列的一致性也超過了80%,與哺乳動物如人的CPR序列的一致性達(dá)到了56%。系統(tǒng)發(fā)育分析得出BdCPR與另外兩個實蠅科昆蟲的CPR距離較近,其中與瓜實蠅CPR的距離最近,與地中海實蠅CPR的距離次之。BdCPR-X1是CPR在桔小實蠅存在的主要形式。BdCPR-X1在桔小實蠅羽化前相對表達(dá)量較低,蛹期最低,在成蟲階段隨著日齡增加而逐漸升高;BdCPR-X2在不同發(fā)育階段的表達(dá)量一直很低。BdCPR-X1在羽化后3日齡雌雄成蟲間的表達(dá)量相似,而在9日齡雄蟲的表達(dá)量顯著高于雌蟲的表達(dá)量,且均高于其在3日齡雌雄成蟲的表達(dá)水平;而BdCPR-X2在3日齡和9日齡雌雄成蟲的表達(dá)量均很低且無明顯差異。BdCPR-X1在雌雄成蟲頭、胸和腹部的表達(dá)水平相近,在雄蟲中腸、脂肪體和馬氏管的表達(dá)量相對較高,在雌蟲脂肪體和馬氏管的表達(dá)量較高,而在雌雄生殖器官(卵巢、精巢和雄性附腺)的表達(dá)量較低;BdCPR-X2在桔小實蠅雌蟲成蟲不同體段和組織的表達(dá)分布與BdCPR-X1相似,但相對表達(dá)量較低。BdCPR-X1和BdCPR-X2在桔小實蠅馬拉硫磷抗性品系和敏感品系的表達(dá)量無顯著差異。利用RNAi技術(shù),體外合成BdCPR的ds RNA并注射到羽化后3日齡成蟲腹部,72 h后BdCPR在成蟲的表達(dá)量下降了52%,且差異顯著,而注射PBS和對照的BdCPR表達(dá)量相近;注射后72 h的成蟲在馬拉硫磷LD50濃度下處理24 h后,對照組的死亡率為45.0%,注射PBS則為50.5%,而注射ds RNA組的死亡率達(dá)到了89.9%,且顯著高于其他兩組,表明BdCPR表達(dá)量下降可以增強桔小實蠅對馬拉硫磷的敏感性。利用Bac-to-bac真核表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中分別表達(dá)BdCPR和e GFP,Western雜交顯示BdCPR和eGFP在細(xì)胞中表達(dá),且表達(dá)有BdCPR的細(xì)胞具有很高的細(xì)胞色素c還原性,而表達(dá)有eGFP以及對照組細(xì)胞的細(xì)胞色素c還原性則很低,表明BdCPR的表達(dá)產(chǎn)物在Sf9細(xì)胞中具有較高的活性;使用馬拉硫磷處理細(xì)胞并用MTT法檢測細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)表達(dá)有BdCPR細(xì)胞的活性普遍高于表達(dá)有eGFP的細(xì)胞,表明BdCPR可能有助于增強Sf9細(xì)胞對馬拉硫磷的耐受能力。4桔小實蠅馬拉硫磷抗性敏感品系轉(zhuǎn)錄組比較分析基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了桔小實蠅馬拉硫磷抗性和敏感品系成蟲和成蟲中腸的數(shù)字表達(dá)譜,以及新建了馬拉硫磷抗性和敏感品系成蟲脂肪體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。6個數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量整體很好,每個樣品的clean reads占raw reads的93%以上。分別比較了抗性和敏感品系成蟲、抗性和敏感品系成蟲中腸、抗性和敏感品系成蟲脂肪體間基因的表達(dá)量差異。桔小實蠅馬拉硫磷抗性品系成蟲相比于敏感品系成蟲(RWB/SWB),表達(dá)量上調(diào)的基因有141個,下調(diào)的基因有278個;馬拉硫磷抗性品系成蟲中腸與敏感品系成蟲中腸(RMG/SMG)相比,表達(dá)量上調(diào)的基因有50個,下調(diào)的基因有988個;馬拉硫磷抗性品系成蟲脂肪體相比于敏感品系成蟲脂肪體轉(zhuǎn)錄組(RFB/SFB),表達(dá)量上調(diào)的基因有349個,下調(diào)的基因有1,192個。差異表達(dá)基因的GO分析表明這些基因涉及不同的生物過程、分布于不同的細(xì)胞組分以及具有不同的分子功能。差異基因的通路分析表明這些基因分布于代謝通路等主要通路上。馬拉硫磷抗性品系成蟲上調(diào)基因中包括2個P450基因CYP6G6和CYP6A2-like,以及1個GST基因,分別上升至9.8、2.2和2.8倍;下調(diào)基因中包括4個P450基因和2個CarE基因。馬拉硫磷抗性品系成蟲中腸下調(diào)基因包括5個GST基因、2個CarE基因和15個P450基因。馬拉硫磷抗性品系成蟲脂肪體上調(diào)基因包括15個P450,上升至2.3-4.3倍(CYP6G6,4.3倍;CYP6A61,4.0倍;CYP4E1-like,3.8倍;CYP6G8,3.4倍;CYP437A3,3.3倍;CYP4D46和CYP309B1,3.0倍;CYP4AC4和CYP12B3,2.9倍;CYP6A13-like,2.8倍;CYP12A4-like,2.7倍;CYP4S18,2.6倍;CYP6D9和CYP12N1,2.4倍;CYP12A5-like,2.3),cytochrome b5,上升至2.1倍,以及兩個GST基因,分別上升至2.7和2.8倍;下調(diào)基因中包括有6個P450基因。5 CYP6G6在桔小實蠅馬拉硫磷抗性中的作用CYP6G亞家族與昆蟲抗性密切相關(guān),桔小實蠅CYP6G6氨基酸序列分別與果蠅CYP6G1、CYP6G2和家蠅CYP6G4氨基酸序列具有47%、51%和48%的一致性,底物結(jié)合位點SRS1-SRS6在4個CYP6G基因間相似性較高,且具有保守的氨基酸。定量結(jié)果顯示CYP6G6基因在桔小實蠅馬拉硫磷抗性品系成蟲的表達(dá)量是其在敏感品系成蟲的5.2倍,且差異顯著,這與桔小實蠅成蟲表達(dá)譜數(shù)據(jù)和成蟲脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。此外,CYP6G6在桔小實蠅成蟲頭部的表達(dá)量較胸部和腹部高,在腹部的脂肪體表達(dá)量較高,但無雌雄差異,而其在生殖器官精巢和卵巢的表達(dá)量較低。CYP6G6在桔小實蠅成蟲的表達(dá)量從羽化后3日齡開始隨著日齡的增加而逐步提高。利用RNAi技術(shù),注射CYP6G6基因的ds RNA至羽化后3日齡的成蟲,在24h后對照組、注射PBS組和注射ds RNA組成蟲的CYP6G6的表達(dá)量相對于內(nèi)參分別為0.63、0.24和0.13,馬拉硫磷處理后各組對應(yīng)的死亡率分別為28.4%、33.2%和39.6%,死亡率略有升高,但由于試驗重復(fù)性不夠穩(wěn)定,各組間差異不顯著。通過真核表達(dá)系統(tǒng),CYP6G6在Sf9細(xì)胞中得到表達(dá),但通過CO差光譜法檢測只在420 nm處出現(xiàn)吸收峰,在450 nm處未檢測到吸收峰;而對照組在420 nm和450 nm處均沒有吸收峰。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2300123