【摘要】：桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)是熱帶和亞熱帶地區(qū)嚴(yán)重危害果蔬的重要經(jīng)濟(jì)害蟲,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不可估計(jì)的損失。由于長期化學(xué)防治的壓力,桔小實(shí)蠅對常用殺蟲劑包括有機(jī)磷類殺蟲劑已產(chǎn)生了不同程度的抗性。前期研究表明,細(xì)胞色素P450在昆蟲對有機(jī)磷類殺蟲劑代謝抗性中起重要作用,而且根據(jù)增效試驗(yàn)以及代謝酶活性測定,桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450與有機(jī)磷類殺蟲劑如馬拉硫磷的代謝抗性密切相關(guān)。據(jù)此,為揭示桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450介導(dǎo)代謝抗性的分子機(jī)理,本學(xué)位論文首先克隆獲得了桔小實(shí)蠅P450基因cDNA全長序列,全面了解桔小實(shí)蠅P450基因的序列信息;定量分析了P450基因在桔小實(shí)蠅體內(nèi)的表達(dá)分布特點(diǎn)和應(yīng)對外源物的反應(yīng);克隆獲得桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450還原酶基因,定量分析了BdCPR表達(dá)分布特點(diǎn),并通過RNAi和真核表達(dá)等技術(shù),探究桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450還原酶基因與馬拉硫磷抗性的關(guān)系,進(jìn)而初步判斷P450酶系在桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性中的作用;通過轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq技術(shù),分析比較了桔小實(shí)蠅成蟲及其中腸和脂肪體在馬拉硫磷抗性品系和敏感品系間表達(dá)量的差異,篩選鑒定出桔小實(shí)蠅中與馬拉硫磷抗性相關(guān)的基因;最后,結(jié)合RNAi和真核表達(dá)等技術(shù)分析P450基因在馬拉硫磷抗性中的作用。本研究為桔小實(shí)蠅的代謝抗性分子機(jī)理建立理論基礎(chǔ),主要研究結(jié)果如下:1桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450基因的克隆與序列分析通過簡并引物、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和RACE技術(shù),共克隆和鑒定出桔小實(shí)蠅38個(gè)具有完整開放閱讀框的細(xì)胞色素450基因。這38個(gè)P450基因分布于4個(gè)集團(tuán)14個(gè)家族27個(gè)亞家族中,其中CYP2、CYP3、CYP4和mitochondrial集團(tuán)分別有2個(gè)、19個(gè)、11個(gè)和6個(gè)P450基因,第四家族和第六家族P450基因分別為11個(gè)和12個(gè),第12家族為4個(gè),其他11個(gè)家族均為1個(gè)。38個(gè)P450基因的開放閱讀框長度介于1350-1665 bp,編碼489-554個(gè)氨基酸。編碼蛋白的分子量介于57-64kDa,理論等電點(diǎn)介于5.88-9.62。通過對序列的分析,預(yù)測38個(gè)P450中有32個(gè)屬于微粒體P450,6個(gè)為線粒體P450。桔小實(shí)蠅38個(gè)P450基因均獲得細(xì)胞色素P450命名委員會(huì)命名,分別為CYP4AC4、CYP4AD1、CYP4D46、CYP4D47、CYP4D48、CYP4E9、CYP4G100、CYP4G101、CYP4P5、CYP4P6、CYP4S18、CYP6A41、CYP6A48、CYP6A49、CYP6A50、CYP6A61、CYP6A62、CYP6D9、CYP6D12、CYP6EK1、CYP6G6、CYP6G8、CYP6GX1、CYP9F6、CYP12A18、CYP12B3、CYP12C2、CYP12N1、CYP28F1、CYP302A1、CYP304A1、CYP305A1、CYP309B1、CYP310C1、CYP314A1、CYP317B1、CYP437A3和CYP3074A1,并在Gen Bank中登錄,登錄號依次為ADC44464、KX708477、ADC44459、ADP22308、ADP22303、ADP22302、KX708478、KX708479、ADC44461、AFH54172、KX708480、ADP22304、KX708481、KX708482、KX708483、KX708484、KX708485、ADO24531、KX708486、ADP22309、KX708487、KX708488、KX708489、KX708490、KX708491、KX708492、AFH54190、AFH54188、AFH54196、AFH54200、KX708493、KX708494、KX708495、AFH54207、AFH54210、KX708496、KX708497和KX708498。多重序列比對顯示11個(gè)CYP4家族成員的氨基酸序列一致性介于25%-67%,12個(gè)CYP6家族成員的氨基酸序列一致性介于26%-60%,相同亞家族成員的序列一致性較高,而不同家族的P450基因序列一致性普遍較低。這些P450基因均具有P450大家族的保守結(jié)構(gòu)域Helix C、Helix I、Helix K、Meander和血紅素結(jié)合區(qū)域等。桔小實(shí)蠅P450基因與實(shí)蠅類害蟲橄欖實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅和地中海實(shí)蠅的同源P450基因氨基酸序列的一致性分別介于79%-97%、74%-95%和70%-94%,序列相似性非常高,與果蠅同源P450基因的序列一致性介于35%-78%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示38個(gè)P450基因和87個(gè)果蠅P450基因按集團(tuán)聚集成4個(gè)不同的分支,其中CYP3和CYP4集團(tuán)的兩個(gè)分支基因最多,相同家族以及同源基因距離較近。2桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)模式解析運(yùn)用q PCR技術(shù),定量檢測了桔小實(shí)蠅P450基因在不同地理種群、不同發(fā)育階段、不同組織以及雌雄成蟲及其中腸間的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示,在桔小實(shí)蠅云南、海南、東莞和廣州等4個(gè)種群中,CYP6P5在東莞和廣州種群的表達(dá)量高于在云南和海南種群的表達(dá)量,CYP6EK1則在廣州種群的表達(dá)量最高,其余6個(gè)被檢測的P450基因在4個(gè)種群的表達(dá)量無顯著差異。在桔小實(shí)蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲中,數(shù)字表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示不同P450基因在數(shù)據(jù)庫中可以對應(yīng)1-4個(gè)片段,相同基因的不同片段對應(yīng)的不同發(fā)育階段的表達(dá)量非常相似,而且與定量檢測結(jié)果一致(CYP4D47除外);8個(gè)檢測的P450基因均在幼蟲和成蟲階段的表達(dá)量較高,其次是蛹期,而在卵期的表達(dá)量則普遍最低;相同亞家族的P450基因CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式具有差異。在桔小實(shí)蠅成蟲不同組織(中腸、脂肪體和馬氏管)中,相同亞家族的CYP4D46、CYP4D47和CYP4D48在中腸的表達(dá)量最高,表達(dá)模式非常相近;CYP4AC4和CYP4E9在脂肪體的表達(dá)量最高,CYP4P5和CYP6EK1在馬氏管的表達(dá)量最高,P450基因在組織間的表達(dá)差異可達(dá)到750倍,而CYP6A41在3種組織的表達(dá)量無顯著差異。在桔小實(shí)蠅3日齡雌雄成蟲中,檢測的15個(gè)P450基因的表達(dá)量均無雌雄差異;而在桔小實(shí)蠅雌雄成蟲中腸,CYP12N1在雌蟲中腸的表達(dá)量是其在雄蟲中腸表達(dá)量的0.28倍,顯著低于在雄蟲中腸的表達(dá)量,其他14個(gè)P450基因在雌雄中腸間無明顯差異。此外,檢測了桔小實(shí)蠅P450基因在外源物處理下的應(yīng)激反應(yīng)。使用高效氯氰菊酯LD50處理成蟲24 h后,15個(gè)P450基因的表達(dá)量均無顯著變化;而在成蟲中腸,CYP4AC4、CYP4D46、CYP4P6和CYP302A1的表達(dá)量在高效氯氰菊酯處理后均下降,分別為對照組的0.33、0.37、0.61和0.53倍,其他11個(gè)P450基因的表達(dá)量在高效氯氰菊酯處理后無明顯變化。使用含3 g/L和10 g/L植物次生物質(zhì)檸檬醛的飼料飼喂桔小實(shí)蠅成蟲,24 h后的死亡率分別為2%和30%;CYP4D46在3 g/L檸檬醛處理后表達(dá)量下降,CYP12N1、CYP302A1和CYP314A1在兩種濃度檸檬醛處理后表達(dá)量均下調(diào),而CYP28F1在3 g/L檸檬醛處理后表達(dá)量上升,CYP4D48和CYP6D9在10 g/L檸檬醛處理后表達(dá)量升高,但增加幅度均較小。3桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450還原酶基因的克隆與功能研究通過簡并引物、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RACE技術(shù),擴(kuò)增出桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450還原酶BdCPR的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本BdCRP-X1和BdCPR-X2,開放閱讀框長度為2019 bp和1674 bp,分別編碼672個(gè)和557個(gè)氨基酸。BdCPR-X1和BdCPR-X2編碼蛋白的理論分子量為76 kDa和64 kDa,理論等電點(diǎn)為5.51和7.23。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的N端序列不同,而C端則一致。BdCPR-X1含有CPR完整的功能結(jié)構(gòu)域FMN、FAD和NADPH,其N端具有膜錨定區(qū)域;而BdCPR-X2具有功能結(jié)構(gòu)域FMN、FAD和NADPH,但FMN不完整,且不具有N端的膜錨定序列。桔小實(shí)蠅BdCPR-X1和BdCPR-X2的氨基酸序列與其他物種的CPR氨基酸序列具有較高的一致性。其中,與瓜實(shí)蠅和地中海實(shí)蠅CPR序列的一致性超過90%,與家蠅和果蠅的CPR序列的一致性也超過了80%,與哺乳動(dòng)物如人的CPR序列的一致性達(dá)到了56%。系統(tǒng)發(fā)育分析得出BdCPR與另外兩個(gè)實(shí)蠅科昆蟲的CPR距離較近,其中與瓜實(shí)蠅CPR的距離最近,與地中海實(shí)蠅CPR的距離次之。BdCPR-X1是CPR在桔小實(shí)蠅存在的主要形式。BdCPR-X1在桔小實(shí)蠅羽化前相對表達(dá)量較低,蛹期最低,在成蟲階段隨著日齡增加而逐漸升高;BdCPR-X2在不同發(fā)育階段的表達(dá)量一直很低。BdCPR-X1在羽化后3日齡雌雄成蟲間的表達(dá)量相似,而在9日齡雄蟲的表達(dá)量顯著高于雌蟲的表達(dá)量,且均高于其在3日齡雌雄成蟲的表達(dá)水平;而BdCPR-X2在3日齡和9日齡雌雄成蟲的表達(dá)量均很低且無明顯差異。BdCPR-X1在雌雄成蟲頭、胸和腹部的表達(dá)水平相近,在雄蟲中腸、脂肪體和馬氏管的表達(dá)量相對較高,在雌蟲脂肪體和馬氏管的表達(dá)量較高,而在雌雄生殖器官(卵巢、精巢和雄性附腺)的表達(dá)量較低;BdCPR-X2在桔小實(shí)蠅雌蟲成蟲不同體段和組織的表達(dá)分布與BdCPR-X1相似,但相對表達(dá)量較低。BdCPR-X1和BdCPR-X2在桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性品系和敏感品系的表達(dá)量無顯著差異。利用RNAi技術(shù),體外合成BdCPR的ds RNA并注射到羽化后3日齡成蟲腹部,72 h后BdCPR在成蟲的表達(dá)量下降了52%,且差異顯著,而注射PBS和對照的BdCPR表達(dá)量相近;注射后72 h的成蟲在馬拉硫磷LD50濃度下處理24 h后,對照組的死亡率為45.0%,注射PBS則為50.5%,而注射ds RNA組的死亡率達(dá)到了89.9%,且顯著高于其他兩組,表明BdCPR表達(dá)量下降可以增強(qiáng)桔小實(shí)蠅對馬拉硫磷的敏感性。利用Bac-to-bac真核表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中分別表達(dá)BdCPR和e GFP,Western雜交顯示BdCPR和eGFP在細(xì)胞中表達(dá),且表達(dá)有BdCPR的細(xì)胞具有很高的細(xì)胞色素c還原性,而表達(dá)有eGFP以及對照組細(xì)胞的細(xì)胞色素c還原性則很低,表明BdCPR的表達(dá)產(chǎn)物在Sf9細(xì)胞中具有較高的活性;使用馬拉硫磷處理細(xì)胞并用MTT法檢測細(xì)胞活性,發(fā)現(xiàn)表達(dá)有BdCPR細(xì)胞的活性普遍高于表達(dá)有eGFP的細(xì)胞,表明BdCPR可能有助于增強(qiáng)Sf9細(xì)胞對馬拉硫磷的耐受能力。4桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性敏感品系轉(zhuǎn)錄組比較分析基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性和敏感品系成蟲和成蟲中腸的數(shù)字表達(dá)譜,以及新建了馬拉硫磷抗性和敏感品系成蟲脂肪體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。6個(gè)數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量整體很好,每個(gè)樣品的clean reads占raw reads的93%以上。分別比較了抗性和敏感品系成蟲、抗性和敏感品系成蟲中腸、抗性和敏感品系成蟲脂肪體間基因的表達(dá)量差異。桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性品系成蟲相比于敏感品系成蟲(RWB/SWB),表達(dá)量上調(diào)的基因有141個(gè),下調(diào)的基因有278個(gè);馬拉硫磷抗性品系成蟲中腸與敏感品系成蟲中腸(RMG/SMG)相比,表達(dá)量上調(diào)的基因有50個(gè),下調(diào)的基因有988個(gè);馬拉硫磷抗性品系成蟲脂肪體相比于敏感品系成蟲脂肪體轉(zhuǎn)錄組(RFB/SFB),表達(dá)量上調(diào)的基因有349個(gè),下調(diào)的基因有1,192個(gè)。差異表達(dá)基因的GO分析表明這些基因涉及不同的生物過程、分布于不同的細(xì)胞組分以及具有不同的分子功能。差異基因的通路分析表明這些基因分布于代謝通路等主要通路上。馬拉硫磷抗性品系成蟲上調(diào)基因中包括2個(gè)P450基因CYP6G6和CYP6A2-like,以及1個(gè)GST基因,分別上升至9.8、2.2和2.8倍;下調(diào)基因中包括4個(gè)P450基因和2個(gè)CarE基因。馬拉硫磷抗性品系成蟲中腸下調(diào)基因包括5個(gè)GST基因、2個(gè)CarE基因和15個(gè)P450基因。馬拉硫磷抗性品系成蟲脂肪體上調(diào)基因包括15個(gè)P450,上升至2.3-4.3倍(CYP6G6,4.3倍;CYP6A61,4.0倍;CYP4E1-like,3.8倍;CYP6G8,3.4倍;CYP437A3,3.3倍;CYP4D46和CYP309B1,3.0倍;CYP4AC4和CYP12B3,2.9倍;CYP6A13-like,2.8倍;CYP12A4-like,2.7倍;CYP4S18,2.6倍;CYP6D9和CYP12N1,2.4倍;CYP12A5-like,2.3),cytochrome b5,上升至2.1倍,以及兩個(gè)GST基因,分別上升至2.7和2.8倍;下調(diào)基因中包括有6個(gè)P450基因。5 CYP6G6在桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性中的作用CYP6G亞家族與昆蟲抗性密切相關(guān),桔小實(shí)蠅CYP6G6氨基酸序列分別與果蠅CYP6G1、CYP6G2和家蠅CYP6G4氨基酸序列具有47%、51%和48%的一致性,底物結(jié)合位點(diǎn)SRS1-SRS6在4個(gè)CYP6G基因間相似性較高,且具有保守的氨基酸。定量結(jié)果顯示CYP6G6基因在桔小實(shí)蠅馬拉硫磷抗性品系成蟲的表達(dá)量是其在敏感品系成蟲的5.2倍,且差異顯著,這與桔小實(shí)蠅成蟲表達(dá)譜數(shù)據(jù)和成蟲脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。此外,CYP6G6在桔小實(shí)蠅成蟲頭部的表達(dá)量較胸部和腹部高,在腹部的脂肪體表達(dá)量較高,但無雌雄差異,而其在生殖器官精巢和卵巢的表達(dá)量較低。CYP6G6在桔小實(shí)蠅成蟲的表達(dá)量從羽化后3日齡開始隨著日齡的增加而逐步提高。利用RNAi技術(shù),注射CYP6G6基因的ds RNA至羽化后3日齡的成蟲,在24h后對照組、注射PBS組和注射ds RNA組成蟲的CYP6G6的表達(dá)量相對于內(nèi)參分別為0.63、0.24和0.13,馬拉硫磷處理后各組對應(yīng)的死亡率分別為28.4%、33.2%和39.6%,死亡率略有升高,但由于試驗(yàn)重復(fù)性不夠穩(wěn)定,各組間差異不顯著。通過真核表達(dá)系統(tǒng),CYP6G6在Sf9細(xì)胞中得到表達(dá),但通過CO差光譜法檢測只在420 nm處出現(xiàn)吸收峰,在450 nm處未檢測到吸收峰;而對照組在420 nm和450 nm處均沒有吸收峰。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 王志超;康志嬌;史雪巖;高希武;;有機(jī)磷類殺蟲劑代謝機(jī)制研究進(jìn)展[J];農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào);2015年01期

2 林玉英;曾玲;陸永躍;金濤;;殺蟲劑對橘小實(shí)蠅毒力測定方法的篩選和應(yīng)用[J];植物保護(hù);2011年04期

3 金濤;曾玲;陸永躍;林玉英;梁廣文;;桔小實(shí)蠅抗性個(gè)體流動(dòng)對抗性個(gè)體頻率的影響[J];昆蟲學(xué)報(bào);2011年03期

4 林玉英;曾玲;金濤;陸永躍;;不同類型殺蟲劑對桔小實(shí)蠅成蟲觸殺作用的毒力敏感基線[J];環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào);2010年02期

5 孫文;伍蘇然;袁盛勇;李正躍;楊仕生;太紅坤;王旭;肖春;;糖酒醋液對甲基丁香酚引誘桔小實(shí)蠅成蟲效果的影響[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年06期

6 劉永杰;沈晉良;楊田堂;肖鵬;賀金;;氯氟氰菊酯對斜紋夜蛾抗性和敏感種群表皮穿透比較[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年07期

7 章玉蘋;曾玲;陸永躍;梁廣文;;華南地區(qū)桔小實(shí)蠅抗藥性動(dòng)態(tài)監(jiān)測[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

8 潘志萍,曾玲,陸永躍;華南地區(qū)桔小實(shí)蠅對幾種農(nóng)藥的抗藥性研究[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年04期

，

本文編號：2300123