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兩種鴕鳥防御素的鑒定、組織分布及抗菌活性研究

發(fā)布時間:2016-12-31 13:18

  本文關(guān)鍵詞:兩種鴕鳥防御素的鑒定、組織分布及抗菌活性研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

兩種鴕鳥防御素的鑒定、組織分布及抗菌活性研究

盧順  

【摘要】:防御素是動物體內(nèi)廣泛存在的一類富含半胱氨酸的抗菌肽,對細菌、真菌、病毒等多種病原微生物均具有抑制作用。防御素抗菌機理獨特,不易產(chǎn)生耐受性,是機體抵御外界病原微生物侵襲的重要武器。由于動物防御素具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥、安全性高等特點,現(xiàn)已成為抗菌藥物研究的熱點。研究表明,禽類防御素(Av BD)均屬于β-防御素,具備廣譜抗菌活性,有開發(fā)成抗菌藥物的潛力。目前關(guān)于禽類防御素的研究較少,僅在雞、鴨、鵝等常見家禽和少數(shù)幾種野禽中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種防御素或防御素基因。在鴕鳥這一古老鳥種也發(fā)現(xiàn)有防御素的存在,但關(guān)于鴕鳥防御素的基因、組織分布、與其他禽類防御素的進化關(guān)系等的研究未見報道,對其抗菌活性和抗菌機理的研究也較少。本研究以此為切入點,采用分子克隆、免疫組織化學(xué)方法和細菌學(xué)技術(shù)等綜合手段,對鴕鳥防御素Av BD2和Av BD7的基因序列、進化關(guān)系、組織分布和抗菌活性等進行研究,旨在為鴕鳥防御素的分子生物學(xué)研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1、鴕鳥防御素基因的克隆與序列分析參考Gen Bank中公布的其他禽類防御素的基因序列設(shè)計引物,以鴕鳥骨髓總RNA為模板,通過RT-PCR擴增到2個鴕鳥防御素基因的c DNA。c DNA序列測定后,用MEGA 5.05軟件和Codon W軟件對基因序列進行同源性分析、進化樹分析和密碼子偏好分析。結(jié)果表明:所擴增到兩個鴕鳥防御素分別是鴕鳥Av BD2和Av BD7,其中鴕鳥Av BD2 c DNA全長195bp,編碼64個氨基酸;鴕鳥Av BD7 c DNA全長201bp,編碼66個氨基酸;同源性分析發(fā)現(xiàn),鴕鳥Av BD2與鵝Av BD2的同源性最高,達86%,其次是雞Av BD2(83%)、鴨Av BD2(83%)和火雞Av BD2(81%);鴕鳥Av BD7與雞Av BD7和鴨Av BD7的同源性最高,均達到81%,與雞、鴨、鵝的Av BD6基因也有75%的同源性;進化樹分析顯示兩鴕鳥防御素與禽類的同類防御素親緣關(guān)系最近;密碼子偏好性分析發(fā)現(xiàn),兩種鴕鳥防御素具有與家禽同類防御素所不同的密碼子偏好;兩種鴕鳥防御素前體均由信號肽、前片段和成熟肽3部分構(gòu)成;兩種鴕鳥防御素具有其他禽類防御素的一些共同特征,例如分子內(nèi)都含有6個保守的半胱氨酸和“GXC”模體。這些結(jié)果為禽類防御素的進化研究以及分子生物學(xué)研究提供了參考。2、鴕鳥防御素的表達與抗體制備按照大腸桿菌的密碼子使用偏好,用密碼子優(yōu)化軟件(Codon Adaptation Tool)對兩種鴕鳥防御素基因的編碼區(qū)(CDS)進行了密碼子優(yōu)化,人工合成優(yōu)化后的基因片段。將合成的基因片段插入原核表達質(zhì)粒PGEX-KG中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)并進行誘導(dǎo)表達。提取表達的重組蛋白,免疫Balb/C小鼠制備抗血清。結(jié)果顯示:人工合成的鴕鳥Av BD2和Av BD7基因在大腸桿菌中成功表達,其中鴕鳥Av BD2的表達量較大;兩種表達蛋白均以包涵體的形式存在,分子量大小約33.5 KD,與預(yù)期結(jié)果相符;用ELISA法檢測免疫后的小鼠血清抗體,效價可達到1:10240。鴕鳥防御素的成功表達以及抗體的制備為其生物學(xué)功能研究提供了幫助。3、鴕鳥防御素的組織分布研究采用RT-PCR和real-time PCR技術(shù)分析了兩種鴕鳥防御素在18種組織中的m RNA表達情況;以制備的鴕鳥防御素多克隆抗體為一抗,用免疫組化法分析了兩種鴕鳥防御素在脾、胸腺、法氏囊、骨髓4種免疫器官中的陽性信號分布。結(jié)果顯示:兩種鴕鳥防御素廣泛分布于不同組織中,但在不同組織中的表達量有差異;鴕鳥Av BD2在骨髓、法氏囊、睪丸、脾臟等組織中表達量較大,在食管、肌胃、胰、卵巢等處表達量較小;鴕鳥Av BD7在骨髓、法氏囊、睪丸、肺等組織中表達量較大,在肌胃、腺胃、胰、肝、卵巢等處表達量較小;免疫組化分析顯示,兩種鴕鳥防御素的陽性信號在4種鴕鳥免疫器官中廣泛分布,其中以法氏囊小結(jié)的皮質(zhì)部以及骨髓組織中的陽性信號最多。鴕鳥防御素組織分布的差異可能提示其在不同組織中所發(fā)揮的主要功能不同。4、鴕鳥防御素的抗菌活性研究根據(jù)推導(dǎo)出的鴕鳥防御素的氨基酸序列,人工合成了鴕鳥防御素Av BD2和Av BD7的成熟肽,并用菌落計數(shù)法驗證了這兩種防御素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、巴氏桿菌和無乳鏈球菌的抗菌活性,以及鹽離子濃度、溫度等對抗菌活性的影響。結(jié)果顯示,兩種鴕鳥防御素對6種細菌具有良好的抑制效果,當(dāng)其濃度達到25μg/m L時抑菌率達到60%,濃度達到100μg/m L時抑菌率可達90%以上;兩種鴕鳥防御素對鹽離子濃度敏感,當(dāng)溶液中氯化鈉濃度達到150m M時,抑菌效果大幅下降。在溫度為-20℃~60℃或p H值為3~10的環(huán)境中處理30min,兩種鴕鳥防御素的抗菌活性未發(fā)生明顯變化。這些結(jié)果為進一步研究鴕鳥防御素的抗菌機理以及鴕鳥防御素的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】:
【學(xué)位授予單位】:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:S852.23
【目錄】:

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9 朱立成;戚正武;;一種新的豆類防御素結(jié)構(gòu)與功能研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2010年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2010年

10 洪旭光;孫修勤;咎金東;曲凌云;張進興;鄭明剛;;皺紋盤鮑防御素(hd-def)的基因組克隆與結(jié)構(gòu)分析[A];中國動物學(xué)會、中國海洋湖沼學(xué)會貝類學(xué)分會第八次會員代表大會暨第十三次全國貝類學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 孫勇如;[N];科技日報;2002年

2 項錚;[N];科技日報;2002年

3 綜合本社駐華盛頓分社記者 毛磊 聯(lián)合國分社記者 丁寶忠;[N];新華每日電訊;2002年

4 劉如;[N];中國醫(yī)藥報;2002年

5 趙紅艷 慕玉 趙寶華;[N];中國食品質(zhì)量報;2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 董開忠;牦牛中性粒細胞抗菌肽分離純化、LAP基因克隆及原核表達[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

2 盧順;兩種鴕鳥防御素的鑒定、組織分布及抗菌活性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 魏洪濤;人β_2防御素的重組表達、純化與活性分析及其mRNA在牙齦上皮的表達[D];吉林大學(xué);2006年

4 王艾平;人α防御素5的基因工程制備及其抗幾種病原微生物的活性研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

5 王國慶;Beta防御素2抗腫瘤作用實驗研究[D];四川大學(xué);2006年

6 肖安東;防御素Defcr4和Mcp-1基因在牛乳腺中表達的研究[D];吉林大學(xué);2005年

7 常玉英;防御素在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用及其分子機制研究[D];四川大學(xué);2006年

8 劉文超;防御素的制備及其抗胃癌的體內(nèi)外實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1997年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周立強;增強人α防御素3殺菌效率的研究[D];上海交通大學(xué);2007年

2 畢馨月;α-防御素對單純皰疹病毒性角膜炎的影響[D];濟南大學(xué);2011年

3 張劍;人防御素α(HD-α)克隆表達純化及生物活性初步檢測[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 胡伶俐;牛殺菌—通透性增加蛋白和防御素基因融合質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 宋斯偉;鼠防御素cryptdin 4在小鼠內(nèi)臟分布及其腸炎模型中表達規(guī)律[D];吉林大學(xué);2007年

6 楊毅;新型防御素基因的克隆與原核表達研究[D];四川大學(xué);2006年

7 龍晶;牛防御素BNBD5的cDNA克隆及畢赤酵母表達[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

8 陳芳;人α防御素-5多肽抗單純皰疹Ⅱ型病毒作用的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

9 陳寶玉;鼠防御素cryptdin 4基因的表達及其活性研究[D];吉林大學(xué);2006年

10 張妮;LPS誘導(dǎo)L929細胞β防御素-2和schlafen-2基因表達及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[D];蘭州大學(xué);2011年


  本文關(guān)鍵詞:兩種鴕鳥防御素的鑒定、組織分布及抗菌活性研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



本文編號:229430

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