發(fā)布時(shí)間：2018-10-21 12:47

【摘要】：病毒侵染產(chǎn)生的大量病毒蛋白阻礙細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能,未/錯(cuò)折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蓄積導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress),誘發(fā)細(xì)胞防衛(wèi)信號(hào)未折疊蛋白應(yīng)答(UPR),或?qū)е录?xì)胞程序性死亡(PCD)。有研究表明植物病毒通過(guò)調(diào)控UPR信號(hào)完成侵染復(fù)制,寄主會(huì)以PCD主動(dòng)消亡的方式抵御病毒。但不同病毒調(diào)控UPR的信號(hào)機(jī)制及信號(hào)強(qiáng)弱尚不明確,尋找UPR和PCD的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,是抗病毒研究的重要方向。為此本文開展了 CMV誘導(dǎo)煙草ER stress及調(diào)控因子NbbZIP28的研究。首先,采用苗期接種鑒定法篩選抗CMV煙草資源,供試的3000余份煙草種質(zhì)多表現(xiàn)中感和高感,獲得1份中抗材料。CMV經(jīng)PEG提純和介導(dǎo)侵染煙草懸浮細(xì)胞BY-2,伊文斯蘭染色鑒定細(xì)胞存亡。結(jié)果顯示:CMV侵染懸浮細(xì)胞后48-72 h,細(xì)胞死亡率顯著高于對(duì)照PBS,72 h達(dá)到90-100%;侵染原生質(zhì)體后24 h導(dǎo)致原生質(zhì)體完全解體。因不易區(qū)分自然凋亡的細(xì)胞和被病毒侵染的細(xì)胞及繼代問(wèn)題,故采用病毒-植株體系研究ER stress。為明確利用液泡膜復(fù)制的CMV是否誘導(dǎo)寄主ER stress,在CMV-IB侵染三生煙或本氏煙體系中,采用qRT-PCR檢測(cè)ERstress相關(guān)基因的表達(dá)量,顯示接種 CMV 后約 12-48 h,ER stress 相關(guān)基因顯著上調(diào)。ER mark(mCherry-HDEL)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后激光共聚焦觀察ER形態(tài),發(fā)現(xiàn)接種CMV后5-10 d,ER膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的重排和增生。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病變細(xì)胞葉綠體降解、線粒體腫脹,且沿液泡膜的微自噬和細(xì)胞質(zhì)中的巨自噬結(jié)構(gòu)增多。上述結(jié)果表明CMV侵染通過(guò)激活ER stress基因、改變ER膜形態(tài)和產(chǎn)生細(xì)胞自噬而誘導(dǎo)寄主細(xì)胞ER stress。其次,研究表明ER stress相關(guān)的UPR是細(xì)胞內(nèi)的保守防衛(wèi)反應(yīng),擬南芥AtbZIP28是ER stress誘導(dǎo)劑衣霉素誘導(dǎo)的UPR信號(hào)分子。為明確病毒侵染應(yīng)激下的NbbZIP28信號(hào),采用RACE和同源克隆鑒定基因,NbbZIP28-GFP、NbbZIP28ΔC-GFP和mCherry-HDEL瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及細(xì)胞核DAPI染色亞細(xì)胞定位蛋白。結(jié)果顯示,NbbZIP28編碼一個(gè)812個(gè)氨基酸的C端含跨膜區(qū)TMD及N端含亮氨酸拉鏈bZIP結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。其前體蛋白定位于ER膜,去TMD及其后C端序列的截短蛋白定位于細(xì)胞核。采用VIGS體系沉默NbbZIP28并檢測(cè)其對(duì)UPR信號(hào)和病毒侵染的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,本氏煙接種TMV或CMV后48h,NbbZIP28的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。與野生型相比,NbbZIP28沉默植株無(wú)顯著表型變化。在病毒侵染早期,沉默植株中病毒的積累量顯著提高;UPR基因(包括NbbZIP28的下游靶基因BiP和NF-YC2)顯著被抑制、后期逐漸恢復(fù)甚至提高。這顯示NbbZIP28為病毒誘導(dǎo)的UPR信號(hào)調(diào)節(jié)子,但不是唯一調(diào)節(jié)子,在病毒侵染早期,通過(guò)激活UPR信號(hào)提高寄主防衛(wèi)反應(yīng)以抵御病毒。最后,為驗(yàn)證UPR信號(hào)分子NbbZIP28調(diào)控病毒侵染的作用,經(jīng)Crispr-cas9基因編輯和煙草遺傳轉(zhuǎn)染創(chuàng)建本氏煙NbbZIP28敲除突變體。突變體在發(fā)芽率、植株性狀上與野生型無(wú)顯著差異。對(duì)病毒的敏感性檢測(cè)顯示,寄主接種病毒早期,突變體植株中病毒(TMV-GFP、CMV)的積累量較野生型顯著提高。鹽、旱脅迫處理種子,發(fā)現(xiàn)突變體與野生型無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明,NbbZIP28為病毒侵染應(yīng)激中的UPR調(diào)控因子,在病毒侵染早期,提高寄主基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng),延緩了病毒的侵染。
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【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S435.72

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2285133