【摘要】：真菌毒素具有較強(qiáng)的毒性,主要污染玉米、小麥等飼料原料,且污染范圍廣泛,嚴(yán)重危害著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康。建立高靈敏度、快速、高通量的免疫學(xué)分析方法是保障畜禽和人類不受真菌毒素危害的重要技術(shù)手段。高親和力族特異性抗體是建立免疫學(xué)分析方法的關(guān)鍵;雙波長(zhǎng)熒光偏振免疫分析方法(Double-Wavelength Fluoresence polarization immunoassay,DWFPIA)是提高檢測(cè)通量的有效方法;新型環(huán)境友好型納米材料的使用是提高側(cè)流層析免疫分析方法(Lateral flow immunoassay,LFA)靈敏度的重要途徑。因此,本論文旨在制備高靈敏度和族特異性的抗體,建立高通量、多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的FPIA和LFA,為真菌毒素的監(jiān)控提供方法手段。同時(shí)使用多種低親和力的競(jìng)爭(zhēng)物,設(shè)計(jì)篩選策略,突破了高親和力和交叉反應(yīng)率均勻的族特異性抗體不能同時(shí)獲得的技術(shù)瓶頸,制備了高親和力和交叉反應(yīng)率均勻的族特異性黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)5H3和玉米赤霉烯酮類化合物(Zearalenones,ZENs)mAb3D4,mAb5H3 針對(duì)黃曲霉毒素 B1(AflatoxinB1,AFB1)的 IC50值是 0.0928ng/mL,與黃曲霉毒素 B2(AflatoxinB2,AFB2)、黃曲霉毒素 G1(AflatoxinG1,AFG1)、黃曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AFG2)、黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)和黃曲霉毒素M2(AflatoxinM2,AFM2)的交叉反應(yīng)率(cross-reactivity,CR)分別是 80.1%、133.7%、81.6%、94.2%和60.9%;mAb 3D4針對(duì)玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的IC50值是0.041 ng/mL,與玉米赤霉酮(Zearalanone,ZAN)、α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenone,α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenone,β-ZOL)、α-玉米赤霉醇(α-Zearalanone,α-ZAL)和 β-玉米赤霉醇(β-Zearalanone,β-ZAL)的 CR分別是66%、107.9%、57.2%、103.5%和73.9%;經(jīng)過盲篩策略,制備了高靈敏度的嘔吐毒素(Deoxynivalenol,DON)的 mAb12E8,針對(duì) DON 的 IC50值是 2.95ng/mL,與 3-乙酰-嘔吐毒素(3-acetyl-deoxynivalenol,3-Ac-DON)和15-乙酰-嘔吐毒素(15-acetyl-deoxynivalenol,15-Ac-DON)的CR分別是2681%和23%;此外,經(jīng)過特異性篩選策略,制備了高特性性的T-2毒素(T-2 toxin,T-2)的 mAb 9C7,針對(duì) T-2 的 IC50 值是 1.12 ng/mL。采用光譜分辨技術(shù),以熒光標(biāo)記物AFB1-EDF和mAb 5H3與ZAN-TRCA和mAb 3D4為最佳熒光標(biāo)記物-抗體組合,建立了同時(shí)識(shí)別AFs和ZENs的DWFPIA,該方法對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2等質(zhì)量混合標(biāo)準(zhǔn)品IC50值2.68 ng/mL,對(duì)玉米樣本最低檢測(cè)限(limit of detection,LOD)是 4.98μg/kg;對(duì) ZEN,ZAN,α-ZAL,β-ZAL,α-ZOL 和 β-ZOL 等質(zhì)量混合標(biāo)準(zhǔn)品的 IC50值是4.08 ng/mL,玉米樣本中的LOD是11.03 μg/kg;添加回收率在78.6-103.6%之間,變異系數(shù)(coefficients of variation,CV)小于 19.2%。合成了不規(guī)則碳納米粒子(Amorphous carbon nanoparticles,ACNPs),建立了同時(shí)檢測(cè)DON、T-2和ZEN的ACNPs-LFA分析方法。在緩沖液中,靈敏度比膠體金提高了 8倍,與量子點(diǎn)的靈敏度相當(dāng);在玉米樣本中可視化檢測(cè)限(visual limit of detection,vLOD)分別是300、150和15μg/kg;定量檢測(cè)限(quantitative limit of detection,qLOD)分別是 19.8、12.9 和 1.04 μg/kg,IC50值分別是 63.3、25.2 和 3.87 μg/kg;添加回收率分別為 87.6-109%,84.6-92.5%和 86-92.5%,CV均小于11.6%;在自然發(fā)生真菌毒素污染的玉米樣本中,其檢測(cè)結(jié)果與HPLC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。綜上所述,本研究制備的高靈敏和族特異性的抗體用于高通量、多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)AFs和ZENs的DWFPIA以及同時(shí)檢測(cè)DON、T-2和ZEN的ACNPs-LFA,能夠滿足這些真菌毒素現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S859.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2263607