【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是重要的油料作物,也是我國(guó)的戰(zhàn)略性物資,在我國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和民族種業(yè)發(fā)展中占有重要地位。我國(guó)南方春大豆種子生理成熟期往往會(huì)遇到高溫多雨的夏季,導(dǎo)致種子發(fā)生田間劣變,嚴(yán)重影響了春大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。植物轉(zhuǎn)錄因子(如TALE家族的兩個(gè)成員KNOTTED-like homeobox (KNOX)和 BEL1-likehomeobox (BELLorBLH))在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫過(guò)程中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),大豆KNOX家族成員GmSBH1能夠參與調(diào)控植株的幼苗形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育以及種子田間劣變抗性過(guò)程。本文擬以田間劣變抗性品種湘豆3號(hào)的大豆種子為材料,構(gòu)建高溫高濕酵母雙雜交cDNA文庫(kù);以GmSBH1蛋白為誘餌,篩選出15個(gè)與種子田間劣變相關(guān)的互作蛋白;利用GST pull-down和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)分別從體外和體內(nèi)驗(yàn)證大豆BELL家族轉(zhuǎn)錄因子GmBLH4與GmSBHl的互作關(guān)系;通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能分析初步明確了 BELL家族在大豆發(fā)育過(guò)程中的作用和進(jìn)化特點(diǎn);利用熒光定量、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子分析以及轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等技術(shù)闡明了GmBLH 基因參與植物形態(tài)建成以及種子田間劣變過(guò)程,為大豆TALE家族參與種子田間劣變抗性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、以田間劣變抗性品種湘豆3號(hào)為材料,采用同源重組的方法,構(gòu)建大豆生理成熟期(R7期)高溫高濕(40×2℃/30±2℃、相對(duì)濕度95±5%晝/70±5%夜、10 h晝/14h夜)酵母雙雜交cDNA文庫(kù),文庫(kù)多樣性和均一性均較好,文庫(kù)效率大于1.0×106,適合用于蛋白與蛋白之間相互作用的大規(guī)模篩選。2、以實(shí)驗(yàn)室前期分離并鑒定的種子田間劣變相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmSBH1為誘餌蛋白,與1中的酵母cDNA文庫(kù)進(jìn)行雙雜交,通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-gal染色共篩選到49個(gè)陽(yáng)性克隆;提取49個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,擴(kuò)繁后進(jìn)行測(cè)序和比對(duì),得到15個(gè)可能與GmSBH1互作的蛋白;利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索15個(gè)互作蛋白的功能,分別為種子成熟蛋白、種子貯藏蛋白、發(fā)育相關(guān)蛋白、蛋白酶抑制劑和功能未知蛋白。3、從15個(gè)互作蛋白中挑選植物發(fā)育相關(guān)基因召EL1-LIKE HOMEODOMAIN 4 (GmBLH4),進(jìn)化樹(shù)分析表明大豆基因組中含有34個(gè)BELL家族基因,并且發(fā)現(xiàn)GmBLH4和擬南芥中的BLH4(SAW2)同源性較高;基因表達(dá)譜分析顯示GmBELLs在大豆葉片、根、莖、花、莢、根瘤、根毛、種子和頂端分生組織(SAM)中差異表達(dá);根據(jù)NCBI和Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)提交的GmBLH4的CDS序列,從大豆cDNA中分離出其完整編碼區(qū)域,序列分析顯示該基因的ORF全長(zhǎng)2022bp,編碼674個(gè)氨基酸;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示其蛋白包含SKY結(jié)構(gòu)域、典型的BEL保守域結(jié)構(gòu)以及Homeodomain結(jié)構(gòu)域;Signa1P網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示GmBLH4不具有信號(hào)肽;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,GmBLH4序列存在α-螺旋(38.58%)、β-轉(zhuǎn)角(6.68%)、延伸鏈(10.39%)和無(wú)規(guī)卷曲(44.36 %);基于煙草表皮細(xì)胞和大豆原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位表明,GmBLH4定位于細(xì)胞核中。4、利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)和GST pull-down以及Western blot技術(shù)驗(yàn)證,無(wú)論體內(nèi)還是體外GmBLH4蛋白都能特異地結(jié)合GmSBH1蛋白。5、GmBLH4與GmSBH1互作關(guān)系與特點(diǎn)的研究結(jié)果表明,GmSBH1的保守結(jié)構(gòu)域 MEINOX (KNOX1 和 KNOX2)和 Homeodomain 都能夠結(jié)合 GmBLH4蛋白,但是GmSBHl編碼區(qū)完整存在時(shí)的活性最高;GmBLH4蛋白中N端(包含SKY和BEL結(jié)構(gòu)域)和C端(Homeodomain結(jié)構(gòu)域)也有利于其結(jié)合GmSBHl蛋白。以上結(jié)果說(shuō)明TALE家族的保守域?qū)τ贙NOX/BELL二聚體的形成很重要。6、GmBLH4基因在大豆中的組織特異性表達(dá)結(jié)果表明,無(wú)論是抗性品種湘豆3號(hào)還是不抗品種寧鎮(zhèn)1號(hào),GmBLH4基因均在花中表達(dá)量最高,根中次之,種子表達(dá)量最低。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的GUS基因染色結(jié)果顯示,GmBLH4在擬南芥的花、幼苗的根和頂端分生組織中高表達(dá),在莢、成熟葉片及種子中不表達(dá)。高溫高濕脅迫下,GmBLH4基因在寧鎮(zhèn)1號(hào)中脅迫處理48h后顯著上調(diào)表達(dá),而在湘豆3號(hào)中處理168 h后表達(dá)才能達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果說(shuō)明GmBLH4基因可能參與調(diào)控大豆頂端分生組織和花器官的生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)也可能參與春大豆種子田間劣變過(guò)程。7、異源表達(dá)結(jié)果表明,GmBLH4基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥葉片卷曲、角果變短以及產(chǎn)量降低等。石蠟切片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株葉片的細(xì)胞排列松散、細(xì)胞間隙較大,柵欄細(xì)胞變短變細(xì),海綿細(xì)胞分布不規(guī)則,近、遠(yuǎn)軸細(xì)胞尤其是遠(yuǎn)軸細(xì)胞變得更小、排列更加緊密。轉(zhuǎn)GmBBLH4基因株系經(jīng)高溫高濕脅迫后,種子發(fā)芽率和生活力明顯高于野生型和突變體blh4植株,與轉(zhuǎn)GmSBH1基因株系種子的耐逆性相當(dāng)。以上結(jié)果表明GmBLH4能夠與GmSBHl形成異源二聚體,并參與影響植物葉片的正常發(fā)育和種子田間劣變過(guò)程。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S565.1
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本文編號(hào)：2261970