【摘要】：傳染病是威脅養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的危害因素之一。偽狂犬病(Pseudorabies,Pr)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PrV))引起的一種高度接觸性動(dòng)物傳染病。Pr對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害很大,15日齡以?xún)?nèi)仔豬感染后死亡率高達(dá)100%,斷奶仔豬發(fā)病后死亡率約10～20%。豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的另一種烈性傳染病,對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前我國(guó)廣泛采用弱毒疫苗接種的方法來(lái)控制Pr和CSF,疫苗使用前一般須要經(jīng)過(guò)生理鹽水稀釋才能注射動(dòng)物。但在很多情況下疫苗不能有效地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生理想的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致免疫失敗。因此,本論文擬研究具有免疫增強(qiáng)作用的疫苗稀釋劑以提高偽狂犬弱毒(attenuated pseudorabies virus,aPrV)疫苗和豬瘟弱毒疫苗的免疫效果,為臨床應(yīng)用提供參考。1.疫苗稀釋劑配方的研究目的:篩選合適的aPrV疫苗免疫增強(qiáng)劑配方。方法:以ICR小鼠為模型,免疫aPrV疫苗,以血清特異性PrV gB抗體為指標(biāo),評(píng)價(jià)白術(shù)多糖(RAMPS)和人參莖葉皂苷(GSLS)的免疫增強(qiáng)作用;以血清PrVgB、PrVgBIgGl、PrVgBIgG2a和攻毒保護(hù)為指標(biāo),評(píng)價(jià)候選稀釋劑配方的免疫增強(qiáng)效果。結(jié)果:GSLS、RAMPS和硫柳汞(TS)均能增強(qiáng)小鼠血清PrVgB抗體水平,以GSLS的免疫增強(qiáng)作用最好。GSLS聯(lián)合RAMPS沒(méi)有協(xié)同作用,GSLS聯(lián)合TS表現(xiàn)出協(xié)同作用,以GSLS-TS(6μg-1μg)的免疫增強(qiáng)效果最為顯著。該配方能提前促進(jìn)血清PrV gB、PrV gB IgG1和PrV gB IgG2a抗體的產(chǎn)生,并能在較長(zhǎng)時(shí)間維持抗體在較高水平。偽狂犬野毒攻毒后,含GSLS-TS的稀釋劑疫苗組小鼠的存活率明顯高于生理鹽水稀釋疫苗組(70%vs40%)。2.滅菌方法和貯存條件對(duì)GSLS-TS免疫活性的影響目的:觀(guān)察滅菌方法和貯存條件對(duì)GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用的影響。方法:以ICR小鼠為模型,分別用不同滅菌方法處理的GSLS溶液和不同貯存條件下保存1年的GSLS-TS溶液稀釋aPrV疫苗后免疫小鼠,以血清特異性抗體水平為指標(biāo),評(píng)價(jià)滅菌方法和貯存條件對(duì)GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用的影響。結(jié)果:高溫(100～121℃)處理和光照均會(huì)顯著降低GSLS-TS的免疫增強(qiáng)效果。因此,GSLS-TS溶液不宜高溫滅菌,并適合在低溫避光條件下保存。3.GSLS-TS和其它6種商品稀釋劑佐劑作用的比較目的:將GSLS-TS溶液與6個(gè)廠(chǎng)家的aPrV疫苗專(zhuān)用稀釋劑進(jìn)行效果對(duì)比。方法:以ICR小鼠為模型,用GSLS-TS溶液稀釋6個(gè)不同廠(chǎng)家的aPrV疫苗,并與它們各自的專(zhuān)用疫苗稀釋劑和生理鹽水進(jìn)行對(duì)比,以血清特異性抗體水平為指標(biāo)。結(jié)果:除“晶制”廠(chǎng)家的稀釋劑外,其它廠(chǎng)家的疫苗稀釋劑免疫增強(qiáng)作用不明顯,與生理鹽水相比沒(méi)有顯著的差異。GSLS-TS溶液的免疫增強(qiáng)作用顯著優(yōu)于生理鹽水和6種專(zhuān)用疫苗稀釋劑。4.GSLS-TS提高豬對(duì)Pr和CSF弱毒疫苗的抗體反應(yīng)研究目的:通過(guò)本動(dòng)物試驗(yàn)觀(guān)察GSLS-TS對(duì)豬弱毒疫苗的免疫增強(qiáng)作用。方法:用GSLS-TS溶液分別稀釋Pr和CSF弱毒疫苗后免疫豬,以血清特異性抗體水平為指標(biāo),評(píng)價(jià)GSLS-TS對(duì)疫苗誘導(dǎo)體液免疫的影響。結(jié)果:GSLS-TS能同時(shí)促進(jìn)豬對(duì)Pr和CSF兩種弱毒疫苗的體液免疫反應(yīng),顯著促進(jìn)血清特異性抗體、抗體亞類(lèi)和中和抗體滴度。5.GSLS-TS對(duì)細(xì)胞免疫的影響目的:評(píng)價(jià)GSLS-TS對(duì)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的影響。方法:用GSLS-TS溶液稀釋aPrV疫苗后免疫小鼠,24h后檢測(cè)脾臟中NK細(xì)胞的殺傷活性、血清中IFN-γ水平;二免二周時(shí),檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖活性和淋巴細(xì)胞中Thl和Th2類(lèi)細(xì)胞因子分泌。結(jié)果:GSLS-TS能快速促進(jìn)疫苗誘導(dǎo)的機(jī)體早期免疫反應(yīng)(NK細(xì)胞殺傷活性、血清IFN-γ產(chǎn)生),顯著增強(qiáng)脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性,提高淋巴細(xì)胞分泌Thl(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-5、IL-10)類(lèi)細(xì)胞因子水平。6.GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用機(jī)制研究目的:初步探討GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用的機(jī)制。方法:將GSLS和(或)TS與小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 共孵育,以miR-132、miR-146a、miR-147 和 miR-155 的mRNA表達(dá)為指標(biāo),分析GSLS或(和)TS對(duì)RAW264.7細(xì)胞中這4種miRs水平的影響;給ICR和C3H/HeJ小鼠免疫aPrV疫苗,以血清特異性抗體、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)以及淋巴細(xì)胞表達(dá)Thl和Th2類(lèi)細(xì)胞因子mRNA的水平為指標(biāo),初步分析GSLS-TS免疫增強(qiáng)作用與TLR4的關(guān)系。結(jié)果:用GSLS或(和)TS與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)能顯著提高細(xì)胞中 miR-132、miR-146a、miR-147 和 miR-155 的 mRNA 表達(dá),而且 GSLS和TS表現(xiàn)出協(xié)同作用;GSLS-TS能同時(shí)提高ICR小鼠和C3H/HeJ小鼠免疫aPrV疫苗后血清特異性抗體反應(yīng),同時(shí)增強(qiáng)Con A和PrV抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖活性以及淋巴細(xì)胞表達(dá)Thl(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-5、IL-10)類(lèi)細(xì)胞因子的mRNA水平,說(shuō)明GSLS-TS的免疫增強(qiáng)作用不主要與TLR4相關(guān)。綜上所述,GSLS和TS對(duì)aPrV疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)具有協(xié)同增強(qiáng)作用,GSLS-TS可顯著增強(qiáng)aPrV免疫小鼠早期免疫反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)以及對(duì)野毒攻毒的抵抗力。本動(dòng)物試驗(yàn)表明,稀釋劑能顯著增強(qiáng)豬對(duì)Pr和CSF弱毒疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng),顯示出較好的臨床應(yīng)用潛力。GSLS-TS的免疫增強(qiáng)作用并不直接通過(guò)TLR4所介導(dǎo),可能與免疫細(xì)胞中miR-132、miR-146a、miR-147和miR-155的表達(dá)上調(diào)相關(guān),關(guān)于稀釋劑的具體作用機(jī)制有待深入研究。
[Abstract]:Pseudorabies (Pr) is a highly contagious animal disease caused by Pseudorabies virus (PrV). Pr is very harmful to the pig industry. The mortality rate of piglets within 15 days of age after infection is as high as 100%, and that of weaned piglets is about 10-10%. 20%. Classical swine fever (CSF) is another severe infectious disease caused by Classical swine fever virus (CSFV), which has caused great economic losses to the pig industry in China. Animals, however, in many cases vaccines can not effectively stimulate the body to produce an ideal immune response and lead to immune failure. Therefore, this paper intends to study vaccine diluents with immune enhancement effect to improve the immune effect of attenuated pseudorabies virus (aPrV) vaccine and attenuated swine fever vaccine for clinical application. Objective: To select the appropriate immune enhancer formula of aPrV vaccine. Methods: ICR mice were immunized with aPrV vaccine, and serum specific PrV gB antibody was used as the index to evaluate the immune enhancement effect of Atractylodes macrocephala polysaccharide (RAMPS) and ginseng stem and leaf saponin (GSLS), serum PrV gB, PrVgBIgGl, PrVgBIgG2a and attack. Results: GSLS, RAMPS and thiomersal (TS) could enhance the level of serum PrVgB antibody in mice. GSLS combined with RAMPS had no synergistic effect, GSLS combined with TS showed synergistic effect, and GSLS-TS (6ug-1ug) had the most obvious effect. This formula can promote the production of serum PrV gB, PrV gB IgG1 and PrV gB IgG2a antibodies in advance, and can maintain a higher level of antibodies for a longer time. AIM: To observe the effect of sterilization and storage conditions on immune enhancement of GSLS-TS. Methods: ICR mice were immunized by diluting aPrV vaccine with GSLS-TS solution treated by different sterilization methods and GSLS-TS solution preserved under different storage conditions for one year. Serum specific antibody level was used as an index to evaluate the immune enhancement. Results: High temperature (100-121 C) treatment and illumination significantly reduced the immune enhancement effect of GSLS-TS. Therefore, GSLS-TS solution is not suitable for high temperature sterilization, and is suitable for storage under low temperature and light-proof conditions. 3. GSLS-TS and other six commercial diluents adjuvant effect comparison purposes: Methods: ICR mice were used to dilute 6 different manufacturers'aPrV vaccines with GSLS-TS solution, and compared with their own special vaccine diluents and saline. Serum specific antibody levels were taken as indicators. Diluents, other manufacturers of vaccine diluent immune enhancement effect is not obvious, compared with normal saline has no significant difference. The immune enhancement effect of.GSLS-TS solution is significantly better than normal saline and 6 special vaccine thinner.4.GSLS-TS to enhance the antibody response of pigs to Pr and CSF attenuated vaccines. Objective: To observe GS through this animal experiment. The immune enhancement effect of LS-TS on swine attenuated vaccine. Methods: immunized pigs were diluted with GSLS-TS solution diluted with Pr and CSF attenuated vaccine respectively. The serum specific antibody level was used as an indicator to evaluate the effect of GSLS-TS on the humoral immunity induced by vaccine. Results: GSLS-TS can also promote the humoral immune response of pigs to two attenuated vaccines of Pr and CSF, and significantly promote the immune response. Serum specific antibodies, antibody subclasses and neutralizing antibody titers. Results: GSLS-TS could rapidly promote the early immune response induced by vaccine (NK cell killing activity, serum IFN-gamma production), significantly enhance the proliferative activity of splenic lymphocytes, and enhance the secretion of Thl (IFN-gamma, IL-12) and Th2 (IL-5, IL-10) cytokines by lymphocytes. Level. 6. GSLS-TS immunopotentiation mechanism: To explore the mechanism of GSLS-TS immunopotentiation. Methods: GSLS and/or TS were co-incubated with mouse macrophage RAW264.7, and the mRNA expression of microRNAs-132, microRNAs-146 a, microRNAs-147 and microRNAs-155 were used as indicators to analyze the effects of GSLS or (and) TS on the levels of these four microRNAs in RAW264.7 cells. Immune aPrV vaccine was given to ICR and C3H/HeJ mice. Serum specific antibodies, lymphocyte proliferation reaction and the expression of Thl and Th2 cytokine mRNA in lymphocytes were used as indicators to preliminarily analyze the relationship between GSLS-TS immunopotentiation and TLR4. Results: When cultured with GSLS or (and) TS and RAW264.7 cells, the expression of Mi-1 was significantly increased. GSLS-TS can simultaneously enhance the serum specific antibody response in ICR mice and C3H/HeJ mice immunized with aPrV vaccine, and enhance the lymphocyte proliferation activity induced by Con A and PrV antigens and the expression of Thl (IFN-gamma, IL-12) and Th2 (IL-5, IL-1) in lymphocytes. To sum up, GSLS and TS have synergistic effects on antibody response induced by aPrV vaccine. GSLS-TS can significantly enhance the early immune response, humoral immune response, cellular immune response and resistance to field virus attack in aPrV immunized mice. This animal experiment shows that thinner can significantly enhance pig's antibody response induced by Pr and CSF attenuated vaccine, showing a good clinical potential..GSLS-TS's immune enhancement is not directly mediated by TLR4, which may be related to the up regulation of miR-132, miR-146a, miR-147 and miR-155 in immune cells. The mechanism needs to be further studied.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2180568